感受态
- 银杏胚乳不同发育时期生理代谢变化与其胚性感受态的相关性研究
力称为植物胚性感受态，它的高低直接决定了能否成功诱导出体细胞胚及难易程度[4]。胚性感受态受外植体的分化状态及外植体类型的影响较大，分化程度越低的细胞去分化能力越强，就越易形成胚性愈伤组织；外植体材料的基因型、发育阶段以及生理状态等决定了其胚性感受态的强弱[9-10]。研究表明，未成熟胚(合子胚的原胚)的胚性感受态明显强于其他阶段[11]。目前全世界已有多种高等植物通过离体培养获得体细胞胚，落叶松(Larixgmelinii)、火炬松(Pinustaeda
南京林业大学学报（自然科学版） 2022年4期2022-11-29
- 高温胁迫下匍匐翦股颖酵母cDNA 文库的构建与鉴定
菌DH10B 感受态细胞进行培养。取培养物10 μL 稀释1 000 倍，均匀在LB 培养基上涂50 μL，第2 天计数，用于后续的结果分析，剩余培养物加入甘油至终浓度20%于-80 ℃存好。1.2.5 制备Y187 酵母感受态细胞 取Y187 酵母感受态细胞在YPDA 培养基上划线，30 ℃倒置培养3 ～5 d。挑取生长出来的单菌落于液体YDPA 培养基中震荡，待OD600值到0.5 左右时，离心后倾析上清液，使用ddH2O 将其重悬，再次离心后使用TE
河北农业大学学报 2022年5期2022-11-21
- 拟南芥ProWRKY12-GUS转基因植株的 构建及其染色分析
杆菌 DH5α感受态细胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL连接产物加入感受态细胞中,轻轻吹打混匀,冰上放置30 min,在42 ℃ 金属浴中热激60 s,再放置于冰上静置 2 min。在热激后的感受态中加入无抗性的600 μL LB 液体培养基,放在 37 ℃ 恒温摇床中低速振荡培养 1.5 h。待培养完成后,涂布于添加了壮观霉素的LB固体培养基上。平板倒置在37 ℃恒温培养箱中培养过夜。次日挑取培养基上的单菌落,接种于添加了壮观霉素的LB液体培养基中,
合肥工业大学学报（自然科学版） 2022年9期2022-10-10
- 拟南芥LecRK Ⅳ.3胞内激酶域的原核表达、纯化及鉴定
料大肠杆菌克隆感受态细胞DH5α,表达感受态细胞BL21,Rosetta,BL21(AI),Rosetta(DE3)pLysS,OverExpress C43(DE3)和pET-30a载体；BamH Ⅰ和HindⅢ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、预染蛋白质分子量标准(10～170 ku)、化学发光的底物(Dura)(美国：Thermo Fisher Scientific)；基因克隆Pfu高保真酶(中国：北京全式金生物)；DNA分子量标准、PCR产物胶回收
河北师范大学学报（自然科学版） 2022年5期2022-09-20
- 鼠伤寒沙门菌CVCC541 rhs 基因内部元件缺失株的构建及其功能
VCC541 感受态的制备及 pKD46 质粒的电转化 将 CVCC541菌液37℃，200 r/min 摇至D600≈0.8，在冰中放置30 min后分装至 50 mL 离心管，4℃、5 500 r/min 离心 5 min，弃掉上清后加入 20 mL 预冷的10%甘油，重悬后4℃、5 500 r/min 离心 5 min，重复 3 次后用 800 μL LB 重悬并分装至预冷的 1.5 mL EP 管中，每支 100 μL。将 5 μL pKD46 加
中国兽医学报 2022年4期2022-06-17
- 枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2电击转化体系的建立
培养阶段、不同感受态细胞浓度、不同感受态细胞量、不同质粒体积、不同转化电压等电击转化条件对电击转化效率的影响进行探索，为建立该菌株的高效遗传转化体系及后续分子遗传学研究及工程菌株改造奠定基础。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 供试菌株及质粒 枯草芽孢杆菌菌株ZT4-2由北京农学院植物保护专业实验室保存；带有GFP标记的穿梭质粒pGFP78(四环素抗性)由中国农业大学植物病理系王琦教授惠赠。1.1.2 供试试剂及培养基 抗生素(10 μg/mL)：四环
北京农学院学报 2022年1期2022-03-10
- 基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记
L。乳酸乳球菌感受态洗涤缓冲液Ⅰ：体积分数为10%的甘油、0.5 mol/L 蔗糖；洗涤缓冲液Ⅱ：体积分数为10%的甘油、0.5 mol/L蔗糖和0.05 mol/L EDTA；洗涤缓冲液Ⅲ：100 mmol/L 乙酸锂二水、10 mmol/L 二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、0.6 mol/L 蔗糖、1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)[19]。1.1.3 酶及试剂盒PremixTaqTM酶、DNA限制性内切酶，大连宝生物
食品与发酵工业 2022年2期2022-02-22
- 大鼠CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体构建及蛋白表达＊
2）细胞与质粒感受态细胞DH5ɑ、BL21购于上海生工生物工程有限公司；nNOS-pME18S质粒由本室保存。1.2 方法（1）引物设计与合成，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。表1 引物序列（2）CaM-nNOS重组表达载体的构建 以nNOS（全长）-pME18S重组子为模板，PCR扩增CaM-nNOS cDNAs（2040bp～2400bp），用1.5%琼脂糖凝胶纯化目的基因。在连接酶的作用下与pGEM-T vector相连
中国科技纵横 2022年24期2022-02-10
- 基于游离质粒的木糖诱导型枯草芽孢杆菌转化体系的建立及其应用
成转化；②自然感受态法[5]。通过控制芽孢杆菌的培养条件，将枯草芽孢杆菌从营养丰富的培养基中转接至营养贫瘠的培养基中，生长到特定的生长阶段，形成感受态；③电击转化法[6]。在瞬时的电脉冲下，菌体上形成小孔，使DNA分子进入。这些方法普遍流程繁琐，对操作技术要求极高，难以大面积推广。芽孢杆菌的自然感受态是细胞易于吸收外源DNA的一个特定理化状态[7]，主要由ComX和CSF信息素组成的菌体密度感应网络介导[8−10]，其中ComK是一个全局调控因子，能激活晚
生物技术进展 2021年6期2021-12-01
- 包涵体重组蛋白不同纯化方法的比较
菌株及质粒 感受态E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）PLysS及E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL购自上海唯地生物技术有限公司；全长IL-1β与全长IL-1Ra重组质粒［9］（以下简称IL-1β-1Ra-2重组质粒）、全长IL-1Ra重组质粒由吉林大学人兽共患病细菌室保存。1.2 主要试剂 IPTG购自北京博奥拓科技有限公司；KCl、NaH2PO4及Na2HPO4购自北
中国生物制品学杂志 2021年7期2021-07-20
- 利用基因工程获取红色荧光大肠杆菌*
理后的大肠杆菌感受态细胞能吸收周围环境中的DNA 分子，利用热激法可将重组质粒导入感受态细胞。目的基因随着重组质粒进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化[3]。本实验采用的质粒含有氨苄青霉素抗性基因，转化成功的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的LB 培养基中存活，并且目的基因可表达出红色荧光蛋白，以上2 点均为筛选转化成功大肠杆菌的依据。2 实验仪器和材料仪器与耗材：恒温水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、移液器、电子秤、锥形瓶、酒精灯
生物学通报 2021年8期2021-07-01
- 唾液乳杆菌电转化效率优化研究
.3唾液乳杆菌感受态制备唾液乳杆菌挑取单菌落接入MRS液体培养基，37 ℃过夜培养。按1%接种量接入50 mL SGMRS培养基，37 ℃培养一定时间后将菌液移入预冷的50 mL离心管，4 ℃ 6 000 g，离心10 min，收集菌体，弃上清。缓冲液Ⅰ洗涤菌体，4 ℃，6 000 g，离心10 min，弃上清。该步骤重复2次。用1 mL缓冲液Ⅱ重悬菌体，按每管100 μL分装至1.5 mL EP管，-80 ℃冻存。接种于SGMRS培养基的菌液分别培养至O
工业微生物 2021年3期2021-06-30
- 噬菌体纳米抗体展示库构建中电转化条件的优化
环境的影响下，感受态细胞的制备以及转化条件都有所不同，故转化效率也存在差异，因此，应该根据实际情况，对电转化条件进行优化进而探索最佳转化条件，提高转化效率。影响电转化效率的因素颇多，除了细菌的生长状态及外源物质的质量外[6]，电压影响细胞膜的穿透性或外源分子与细胞膜的融合[7]，T4 DNA连接酶也会降低转化效率[8]。此外，电转化结果受到众多因素的综合影响，实际上各个因素不是孤立存在的，而是相互联系、相互作用的。为此，本研究旨在利用Bio-Rad公司的电
宁夏医科大学学报 2021年5期2021-06-22
- 酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子
iacoli)感受态Mac1-T1 Competent Cell、DH5α农杆菌感受态。DH10B、Y187购自上海唯地生物技术有限公司。1.2 试验方法1.2.1 小麦cDNA构建文库是利用Clontech Mate&Plate TM Library Construction方法进行构建。并运用Trizol方法[19]，提取总的小麦RNA并融解在RNase-free H2O中，用超微量分光光度计仪器测量RNA的纯度与浓度。分离纯化后，根据Fast Tra
浙江农业学报 2021年3期2021-04-01
- 大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及验证
liTop10感受态细胞中，小提质粒，用测序引物pKD_Seq5测序鉴定。将构建好的质粒命名为pKDsgRNA-kan-DwaaL。1.5waaL基因同源修复供体DNA片段的扩增以E.coliW3110基因组为模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R、DwaaL-2F和DwaaL-2R为引物，使用PrimerStar高保真酶PCR扩增片段3和片段4。PCR产物经核酸凝胶电泳鉴定、回收后，以DwaaL-1F和DwaaL-2R为引物，使用PrimerStar高
中国兽医学报 2021年1期2021-03-10
- 棉花角斑病菌V8高效电转化条件的探索
中期的V8制备感受态细胞;保证电压2.1 kV、50 μg/mL质粒7μL、4℃预冷复苏培养基SOC、振荡复苏培养4-5 h时，V8的电转化效率高达5×102/μg DNA。关键词：棉花角斑病菌[Xanthmona scampestris pv.malvacearum （Xcm） ]V8;菌株驯化;电转化条件;电转化效率中图分类号：Q78;S435.621.2+5文献标识码：A文章编号：0439-8114（ 2020）12-0175-04D01：10.14
湖北农业科学 2020年12期2020-08-28
- His-prescission蛋白酶基因在大肠杆菌中表达条件的优化
1菌种大肠杆菌感受态细胞，BL21(DE3)-T1R，北京天根生化科技有限公司；Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)，上海拜力生物科技有限公司。1.2 试剂及仪器核酸蛋白测定仪，赛默飞世尔科技公司；双稳定电泳仪，北京六一仪器厂；干浴微量恒温器、脱色摇床，其林贝尔仪器制造有限公司；紫外分光光度计，上海优尼柯有限公司；双层试管摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；生物洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。1.3质粒的提取及菌种的转化①含His-
安徽化工 2020年3期2020-07-01
- 产蛋主要基因对籽鹅产蛋性能的影响研究
转化至DH5α感受态中，扩增培养后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，使用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ对重组质粒进行酶切鉴定，并将重组质粒进行测序，将测序结果进行Blast比对。将酶切后的FSH、PRL、INH基因进行回收，将FSH基因与与pcDNA3.0载体相连接，PRL、INH基因与pET-32a载体连接，将重组pET-32a-PRL及pET-32a-INH载体转化至BL21感受态细胞中，将重组pcDNA3.0-FSH转化至DH5α感受态中，扩增培养
吉林畜牧兽医 2020年4期2020-06-02
- 基于退火缓冲液的SLiCE无缝克隆方法的改良
于高转化效率的感受态细胞，例如Zhang等［7］采用1×1010CFU/μg电转化效率的感受态细胞和1×109CFU/μg的化学转化效率的感受态细胞，Motohashi［13］则采用的是1×108CFU/μg化学转化效率的感受态细胞。商业化的高感受态细胞价格不菲，但自制高感受态细胞工序较为繁琐，且转化效率往往不稳定，因此很多无缝克隆方法建立时都考虑到了感受态细胞效率这个因素［6，14］。对于无缝克隆的高感受态细胞依赖问题，Zhang等［7］将λ噬菌体Red
生物技术通报 2020年2期2020-02-22
- 大肠杆菌感受态细胞制备及转化研究现状
5000)1 感受态细胞的起源、概念及原理1970年MANDEL和HIGE[1]发现大肠杆菌细胞经CaCl2溶液处理时能够吸收λ噬菌体DNA，细胞这种能够吸收DNA的状态称感受态。使用理化方法诱导细胞，改变细胞膜状态，增强细胞膜的通透性，细胞膜表面性状发生暂时性改变，方便外源基因或者载体进入受体细胞，这种处于最适摄取和容纳外来DNA状态的细胞称为感受态细胞(competent cell)。由于细胞膜具有流动特性，细胞膜通透性随后会逐渐自动修复。转化(tra
河北北方学院学报（自然科学版） 2020年8期2020-01-18
- 利用CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌tnaA基因
oliDH5α感受态细胞中，小提质粒，用测序引物gRNAP F/gRNAP R测序鉴定。将构建好的质粒命名为pTargetF-tnaA。本研究所用引物和gRNA寡核苷酸序列见表1。表1 gRNA和引物1.4 tnaA基因同源修复供体 DNA的构建以E.coliw3110-Δ基因组DNA为模板，tnaA L F、tnaA L R为引物，PCR扩增获得片段1，以tnaA R F、tnaA R R为引物，PCR扩增获得片段2。以AmlF和AmlR为引物，将片段1
生物学杂志 2019年6期2019-12-19
- 细菌遗传物质的转移有哪些方式
态被称为细菌的感受态。有些细菌自诞生的时候就处于感受态的环境中，而有一些则需要外界的特殊刺激才能转变为感受态，这也把细菌的感受态分成了自然感受态和人工感受态两种。不同种类的细菌实现感受态的方式也不尽相同，例如本身就可以实现感受态转变也就是自然感受态的细菌代表有枯草芽孢杆菌，而需要通过人工干扰才能实现感受态的细菌典型代表是大肠杆菌，一种在生活中尤其常见的细菌。细菌遗传物质转化方式的不同还取决于对外部环境的反应，在自然界的生态系统中，大部分细菌都是来源于土壤之
学习与科普 2019年17期2019-09-10
- 申克孢子丝菌STE20基因RNA干扰菌株的构建方法
活，冰上冷却。感受态细胞的制备 将DH5α菌保接到LB液体培养基中，将接菌后的试管于温度37℃，220 r/min，培养16 h。然后转接到50 mL LB液体培养基中(按约1∶100的量转接)，220 r/min，37℃培养到OD6000.6。然后，将培养物加到50 mL离心管中冰上预冷10 min。4℃，4000 r/min离心5 min，弃去上清。用预冷30 mL的CaC12(0.l mol/L)重悬，冰上放置30 min，然后，4℃，4000 r/
中国真菌学杂志 2019年3期2019-07-10
- 枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统及其潜在生防应用
体的群集运动、感受态的形成、抗生素的合成、γ-聚谷氨酸的合成、生物膜的形成和致病基因的表达等细胞行为。这种对群体密度刺激做出反应的基因调控系统称为群体感应(Quorum sensing, QS)系统[2-5]。对近年来枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中感受态调控系统ComQXPA(Com是compotence的缩写)的组成、系统在菌体生长繁殖过程中的重要调控机制、枯草芽孢杆菌作为生防菌在农业方面应用的作用机制等方面的研究进展进行了总结，并针
河南农业科学 2019年6期2019-06-28
- 肉葡萄球菌电转化条件的优化
壁较厚且致密，感受态细胞接收外源载体困难，常规的热激转化法几乎无法使外源 DNA进入宿主细胞．目前，肉葡萄球菌的外源 DNA转化方法主要有原生质体转化方法和电转化方法．原生质体转化方法操作复杂、花费时间较长且转化效率较低，而电转化法操作简便、理论转化效率高，因而得到广泛的应用[4]．电转化法的原理是使用瞬时电压使得细胞膜被极化而产生瞬时孔洞，使 DNA等外源物质快速进入到细胞内[5]．电场强度和脉冲持续时间在一定范围内时，细胞的瞬时通透性是可逆的．随着电场
天津科技大学学报 2019年3期2019-06-21
- 利用响应面法优化发酵乳杆菌AR497电转化条件
杆菌AR497感受态制备方法MRS液体培养过夜，3%接种量接种至含质量浓度20 g/L甘氨酸的MRS液体培养基至OD600为0.3～0.4。 4 ℃，4 000×g离心弃上清，体积分数为10%甘油洗涤2次并重悬分装[7]。每管分装100 μL保藏-80 ℃，电转化备用。1.3 发酵乳杆菌AR497感受态效率检测及鉴定方法取一定量质粒与100 μL感受态细胞混匀，迅速转入预冷无菌的电转杯中，设置好电转参数后电击。电击完毕后，立即加入900 μL液体复苏培养基
食品与发酵工业 2019年7期2019-05-07
- 嗜热链球菌的电转化条件
ophilus感受态细胞的影响按1%的接种量将S.thermophilussp1.1接入含有不同浓度甘氨酸的培养基(甘氨酸质量浓度为0、10、20、30、40、50 g/L)中进行培养，测定其12 h的生长曲线，以甘氨酸0 g/L的为对照。1.3.3 菌体生物量对电转化率的影响按1%接种量将S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液体培养基中，37 ℃培养，收集OD600为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的菌体，制备S
食品与发酵工业 2019年6期2019-04-04
- 副猪嗜血杆菌高自然转化效率菌株的筛选及全基因组测序
细菌被称作自然感受态细菌(naturally competent bacteria)[11-12]。HPS同样展现出了自然转化的能力[5]。自2004年Bigas等[13]以该菌自然转化系统为基础，创建了一套在HPS上的基因操作技术，借此构建该菌的基因缺失株来研究相关基因功能，HPS自然转化的应用便推广开来。与接合转移、转导相比，自然转化的发生很少受到外源DNA的影响及转化方法的局限，如感受态细菌的制备。自然转化只与受体菌的诱导相关,且操作相对简单[14]
畜牧兽医学报 2018年11期2018-11-30
- 蓝杆藻ATCC 51142中α-酮戊二酸脱羧酶的克隆与表达
21(DE3)感受态细胞后得到表达菌株。摇瓶培养表达菌株经阿拉伯糖和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后纯化得到cce4227重组蛋白。本研究为进一步阐明cce4227蛋白的催化功能及机制奠定了重要基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和载体 试验于2017年11月至2018年1月在江西农业大学生物科学与工程学院分子生物学实验室完成。pTf16分子伴侣质粒、大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞、表达载体pET28a为笔者所在实验室保存；蓝杆藻AT
江苏农业科学 2018年19期2018-11-08
- 电转化条件对大肠杆菌TG1转化效率的影响
环境的影响下，感受态细胞的制备以及转化条件都有所不同。为提高平末端连接、转化效率，进而建立较高质量的文库，因此本研究通过比较不同电转化条件下大肠杆菌TG1的转化效率，为后续噬菌体展示基因文库的建立奠定基础。1 试验材料与方法1.1 试验材料与主要仪器大肠杆菌菌株TG1本室-80 ℃保存；pDJ01质粒为梅西大学Jasna Rakonjac教授惠赠，-80 ℃保存；大肠杆菌TG1株购自广州碧云天生物有限公司；质粒提取试剂盒购自康为世纪生物有限公司。LB液体培
吉林农业科技学院学报 2018年3期2018-10-10
- 香榧幼胚发育与胚性感受态之间的相关性
00）植物胚性感受态为植物细胞或组织脱分化能力或潜力，胚性感受态的高低直接决定了植物体细胞胚诱导的难易程度［1］。研究发现，大多数植物的组织或细胞维持高水平胚性感受态的时间极短［2-3］。胚性感受态水平的高低与基因型、外植体的取材部位、生理学年龄等密切相关［4］。在黑核桃Juglans nigra中，授粉后3～4周的幼胚开始具有体胚发生能力，授粉后6～7周时幼胚体胚发生频率最高，此后，体胚发生能力逐渐下降［5］。在梨Pyrus中，具有胚性感受态的时间极短，
浙江农林大学学报 2018年5期2018-09-28
- 传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建
1.2 质粒与感受态细胞 Pad-Track-CMV穿梭载体、pAd-easy-1骨架载体、DH5α感受态细胞、DH10B感受态细胞和BJ5183感受态细胞，均购自武汉金开瑞生物科技有限公司。1.1.3 试 剂 RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、Quick-Fusion快速克隆试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA聚合酶和限制性内切酶，均购自美国纽英伦生物技术(NEB)；RNA反转录试剂盒，购自德国罗氏公司(Roche)；脂质体2000，购自美国英杰生命技术有限
西北农林科技大学学报（自然科学版） 2018年5期2018-05-24
- 犬瘟热病毒H、F和N基因的克隆及原核表达
rans-T1感受态、Transetta (DE3)感受态购自北京全式金公司；Ni-NTA Sefinose(TM) Resin购自生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自碧云天公司。（2）PCR引物。根据GenBank中发表的CDV Onderstepoort毒株基因序列，用Primer premier 5软件设计了三对特异性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2，引物序列如表1所示，并在PCR产物上、下游分别引入酶切位点，引物由
兽医导刊 2018年7期2018-04-24
- 人参3-O-UGT1基因RNAi表达载体工程菌的构建
本实验室保存;感受态大肠杆菌JM109、pMD20-T载体、pBI121植物双元表达载体、总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶以及各种限制性内切酶等，均购于宝生物工程(大连)有限公司；卡那霉素购自于北京鼎国生物制品有限公司。2 试验方法2.1 RNA干扰元件核心片段的获得由GenBank得到原人参二醇3号位葡糖糖基转移酶1基因(Pg3-O-UGT1；JX898529)序列，通过Clustal X软件将其核
吉林大学学报（工学版） 2018年1期2018-03-10
- 响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究
发掘乳酸乳球菌感受态潜力奠定基础，为提高乳酸乳球菌感受态效率提供新思路。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 质粒试验所用的质粒pNZ44 为乳杆菌穿梭质粒。1.1.2 培养基GM17 培养基：用于乳酸乳球菌NZ9000 的活化、培养和活菌计数。配方为：胰蛋白胨5 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母浸出粉2.5 g/L、β−磷酸甘油二钠19 g/L、维生素C 0.5 g/L、MgSO40.25 g/L。固体培养基另
上海理工大学学报 2018年6期2018-02-25
- 松嫩盐单胞菌中Group 2 mrp操纵子敲除及突变株耐盐碱分析
2.1 电转化感受态细胞制备挑取NEAU-ST10-39T单菌落于5 mL含3%NaCl HLB液体培养基中，35℃，145 r·min-1振荡培养16 h；按2%接种量转接于200 mL含3%NaCl HLB液体培养基中，160 r·min-1振荡培养2～3 h，期间注意监测菌体OD600吸光度值；待OD600吸光度值达0.6～0.8后停止培养，冰浴菌液20～30 min；离心收集菌体；去除培养基后用20 mL去离子水重悬菌体，离心，洗涤菌体1次，去除残
东北农业大学学报 2017年12期2017-12-29
- 质粒DNA的转化、提取及酶切分析
肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选培养充分克隆，然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA，最后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA，并跑电泳鉴定。人Bcl-2基因；质粒转化；CaCl2法；质粒提取；碱裂解法；酶切分析本研究介绍人Bcl-2重组质粒DNA的转化、分离提取和内切酶酶切鉴定。1 材料与方法1.1 试剂不含氨苄青霉素的LB液体培养基、含氨苄青霉素的LB液体培养基、100mg/ml氨苄氨基酸溶液、人Bcl-2重组质粒、大肠杆菌DH5α、75%乙醇；碱裂解法试剂溶
保健文汇 2017年6期2017-11-02
- 枯草芽孢杆菌SCK6超级感受态的制备和转化条件优化
菌SCK6超级感受态的制备和转化条件优化李信志，卢争辉，周玉玲，李世宇，张桂敏湖北大学生命科学学院生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，湖北武汉 430062枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性好氧细菌，因其安全性和高分泌特性，已被广泛用作异源蛋白的表达宿主。然而，相比大肠杆菌，枯草芽孢杆菌的转化效率低，限制了其作为宿主的异源蛋白的定向进化。本文通过改变培养基、诱导剂浓度、质粒类型等参数优化感受态制备的条件，利用常规质粒进行转化，结果表明，用营养丰富的YN培养基替代
生物工程学报 2017年4期2017-05-06
- 大肠埃希菌TG1电穿孔法转化条件优化研究
态、电场强度、感受态细胞浓度和体积、外源基因的质量、甘油/甘露醇缓冲液体积等条件进行优化，分析了各因素对转化效率的影响。结果显示：细菌培养温度为16℃，细菌生长的OD600值为0.5，密度梯度离心洗涤法，感受态细胞浓度高于1×1011/mL，并设定电场强度14.25 kV/cm时进行电穿孔，转化效率最高，可达到9×109CFU/μg DNA。研究获得的电转化优化条件为高库容文库的构建提供了一个重要的途径。大肠埃希菌TG1;电穿孔转化;转化效率基因文库(ge
生物技术进展 2017年1期2017-02-20
- 格里菲斯肺炎双球菌转化实验的细胞机制
力的细胞被称为感受态细胞。这个转化的过程大致分为三步：首先，R型菌成为感受态细胞，接着感受态细胞摄取外源DNA，最后外源DNA在该细胞中进行同源重组。2.1 R型菌成为感受态细胞 成为感受态细胞是摄取外源DNA的前提。肺炎双球菌感受态的调控主要涉及五个蛋白(ComABCDE)，它们共同组成一个群体感应系统。ComC编码感受态信息素(CSP)前体，当细胞外CSP积累到可以发生感受态临阶浓度时，与膜结合蛋白ComD结合使其磷酸化，当磷酸基团转移到ComE上，它
生物学教学 2017年10期2017-02-18
- Ca2+和Sr2+诱导大肠埃希菌感受态细胞的形成及转化的影响
诱导大肠埃希菌感受态细胞的形成及转化的影响王永刚1, 孙尚琛1, 马雪青2, 秦健宇1, 冷非凡1(1.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050； 2.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)为研究金属离子诱导下感受态细胞形成的机理及揭示转化发生的机制，分别用Ca2+和Sr2+(0～140 mmol/L)制备大肠埃希菌感受态细胞并转化。研究结果表明，不同浓度的Ca2+和Sr2+诱导的感受态细胞的效价不同，两种金属离子对大
微生物学杂志 2016年2期2016-12-21
- 芍药ITS片段重组质粒的构建及筛选
菌E.coli感受态细胞（competent cell）中，并利用质粒载体上含有的β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列，使重组体在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，β-半乳糖苷酶将底物半乳糖苷（X-Gal）水解，形成蓝色菌落，而有外源DNA片段重组质粒的细菌则形成白色菌落的过程。芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属多年生草本植物，有较高的观赏和药用价值[4,5]，但品种变异丰富，表型性状多样[6]，给芍药的准确分类
三门峡职业技术学院学报 2016年3期2016-11-30
- 植物乳杆菌G63电转化方法的优化
中期的细胞制备感受态，以1 g/100 mL甘氨酸作为细胞弱化剂，分别用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇1000洗涤细胞，并用30 g/100 mL聚乙二醇1000作为电击液，加入20 μg穿梭质粒，在1.5 kV和400 Ω条件下进行电击，可以获得最高的电转化效率，转化效率达到1.18×103CFU/μg DNA，满足后续遗传学实验要求。植物乳杆菌；电转化；转化效率乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指
食品科学 2016年3期2016-11-11
- 肠出血性大肠杆菌z4832基因缺失突变株的构建
肠杆菌DH5α感受态细胞、pEASY-T1 simple载体和大肠杆菌BL21（DE3）表达感受态细胞购自北京TransGen生物技术有限公司。1.1.2 引物设计 PCR引物由中美泰和生物技术有限公司合成（表1），其中U1-HindⅢ、U2-SalⅠ用于扩增z4832基因上游500 bp同源臂（z4832-up）；D1-BamHⅠ、D2-EcoRⅠ用于扩增z4832基因下游500 bp同源臂（z4832-down）；kana-SalⅠ、kana-BamH
安徽医科大学学报 2016年8期2016-11-11
- 携带BARF1基因的重组巨细胞病毒的构建
1SW102电感受态细胞的制备常规方法制备SW102电转感受态细胞，-80 ℃保存。2.2制备含有巨细胞病毒细菌人工染色体(T-BAC)的SW102细胞将T-BAC质粒DNA电转到SW102电感受态细胞，转移到1 mL LB培养液，32 ℃孵育1 h；离心，用1×M9液洗涤沉淀2次，涂布于含有氯霉素的LB琼脂培养基，32 ℃ 培养1 d后，有克隆形成，挑选4个克隆，提取质粒DNA，PCR(用巨细胞病毒开放读码框UL57引物：Forward: 5′-agac
中国人兽共患病学报 2016年7期2016-08-24
- 载体浓度和感受态对大分子载体转化效率的影响
)载体浓度和感受态对大分子载体转化效率的影响覃鸿妮1， 张兰兰2(1.苏州工业园区服务外包职业学院,江苏苏州 215123；2.金唯智(苏州)生物科技有限公司，江苏苏州 215123)[目的]研究载体量和感受态对阳性克隆率的影响。[方法]利用引物拼接PCR技术，自行设计26条引物合成一个835 bp的目的基因，将该基因与约20 kb的大分子载体连接构成重组质粒。在1 500 ng目的基因底物量的基础上，设置50、100、150、200、250、300 n
安徽农业科学 2016年17期2016-08-11
- 滥用抗生素的危害
素还会诱导细菌感受态的产生。感受态是细菌的一种容易接受外源基因片段的状态。例如，肉类制品上如果残留有耐药基因片段，很容易被体内处于感受态的细菌接受，从而造成人体细菌耐药性的增强。厂家、药店、医院，受利益驱动，热衷于生产、销售、使用抗生素药品，这是根本原因。药监部门监管不力，也难辞其咎。针对目前抗生素市场流通方面存在的问题，由于无法对药店持有的药方进行核实，药监部门开展的清查整顿效果有限。更关键的是科学教育和普及工作不到位，许多患者缺乏合理使用抗生素的常识，
阅读（科学探秘） 2016年9期2016-05-30
- 对“肺炎双球菌转化实验”的几个疑难问题的解答
的细菌必须处于感受态(最易于接受外源DNA片段并能实现转化的一种状态)，调节感受态的一类特异性蛋白称感受态因子，主要包括膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶等，人工条件下可用环腺苷酸(cAMP)或Ca2+处理受体菌使其处于感受态；③转化还受到转化因子的大小和浓度的影响。肺炎双球菌的转化(R型菌转化为S型菌)是同种细菌不同品系间的转化，具体过程如下：处于特定生长期的R型菌分泌感受态因子(细胞壁自溶素)，细胞壁局部缺失，使细胞表面的膜连结合蛋白和核酸
生物学教学 2016年11期2016-04-10
- 肺炎双球菌转化实验难点剖析
R型菌必须处于感受态。感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的生理状态。它虽受遗传控制，但表现却差别很大。外界环境因子如环腺苷酸（cAMP）和Ca2＋对感受态有重要影响。如cAMP可使嗜血杆菌属的细菌感受态水平提高1万倍。处于感受态的R型细菌分泌感受态因子，其中有细胞壁自溶素，使R型细菌的局部细胞壁溶解掉，从而使其细胞膜表面的膜连DNA结合蛋白和核酸酶暴露出来。转化因子是离体的DNA片段。一般原核生物的拟核是由一个大型的环状DNA分子反复折叠
教学考试(高考生物) 2016年3期2016-04-09
- pUC19-pbp2b重组质粒转化对肺炎链球菌感受态菌株耐药性的影响▲
化对肺炎链球菌感受态菌株耐药性的影响▲赵卫东1忽胜和2杨新原2孔 山1(1 云南省大理大学临床医学院检验诊断学教研室，大理市 671000，E-mail：wdzhao1229@foxmail.com；2 云南省大理大学第一附属医院检验科，大理市 671000)目的 探讨pUC19-pbp2b重组质粒转化对肺炎链球菌(SP)感受态菌株耐药性的影响。方法 收集13株对青霉素不敏感的SP菌株，其中8株青霉素结合蛋白(PBPs)编码基因pbp2b未突变，5株pbp
广西医学 2016年11期2016-02-17
- DNA处理蛋白A在细菌自然转化中的作用
作用，通过限制感受态刺激因子的早期基因表达，参与细胞感受态的关闭过程。本文对DprA蛋白在细菌自然转化中的作用进行综述。DNA处理蛋白A；细菌；自然转化自然转化是一种重要的生物学现象，它是细菌水平基因转化的一种基因程控机制。不同于转导或接合等其他机制，它利用DNA摄取泵导入DNA，不需要额外染色体或移动因子[1]。细菌自然转化的意义：抗药性基因在病原菌之间快速水平转移，以自然转化过程中摄取的外源DNA为模板，通过同源重组方式修复受损染色体，是维持遗传多样性
解放军医学院学报 2015年10期2015-03-21
- 小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建
。1.2.3 感受态细胞的制备：1.2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 将菌液转入50 mL离心管中，冰上放置10 min。4℃，4 000 r/min离心10 min。弃去上清，将管倒置1 min使培养液流尽，用冰上预冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30 min。0～4℃4 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入2 mL预冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置，即可获得DH
中国医科大学学报 2015年3期2015-01-02
- 一种电击转化枯草芽孢杆菌方法的优化
中，能自发形成感受态的菌株极少，且感受态持续时间短暂，分子克隆效率低，从而限制了外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效表达［3］。目前外源基因导入宿主菌的主要手段有感受态法［4］、原生质体转化法［5］和电击转化法［6］。其中，电击转化法被认为是转化效率最高的一种方法。然而，电击转化过程中需要平衡转化效率和死亡率的关系，随着电场强度的增加，外源DNA进入宿主细胞的可能性越大，死亡率也随之增加。陆雁等［7］以不同预培养时间优化复制子转化至枯草芽孢杆菌WB600中，最高
重庆理工大学学报(自然科学) 2014年8期2014-06-27
- PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析*
浓度，胶回收，感受态质量，LB平板质量，内切酶，连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。PAI-1；启动子；荧光素酶报告基因；载体连接基因重组技术是我们在分子生物学研究中较常使用到的基本技术，也是分子生物学实验的基础，它在现代中医药的研究中应用越来越广泛。载体构建是将外源性DNA目的片段通过重组技术转化入受体细胞中繁殖及表达，人工构建为需要的目的质粒，为进一步实验做基础[1，2]。当外源性DNA片段插入到相应载体内时，由于操作方法繁琐，所需时间长，人为
中国医药指南 2014年12期2014-04-13
- 猪瘟病毒酵母双杂交pGBKT7-NS3诱饵载体的构建与鉴定
接酶、DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、YPDA培养基、SD各种缺陷性培养基、酵母菌株 Y2HGold、X-α-gal、Aureobasidin A、酵母转化试剂盒、c-Myc抗体为Clontech公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品。1.1.2 引物合成和设计 根据GenBank上猪瘟病毒石门株（登录号：AF
动物医学进展 2014年8期2014-03-06
- 苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立
，质粒加入Bt感受态细胞中很容易被降解，低浓度的质粒直接影响了电转化效率，而经蛋白酶K处理后的Bt感受态细胞对质粒的降解作用大大下降，显著提高了转化效率.研究还对电转化相关因素进行了优化，包括培养基成分及渗透压、培养时间、电转化缓冲液、电场压、质粒DNA的浓度等.利用该方法，在Bt中建立了一种稳定高效的电转化方法.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)为本研究室选育的野生型Bt菌株.Bt菌株
湖南师范大学自然科学学报 2013年2期2013-10-11
- 大肠埃希菌DH5α感受态细胞转化率变化的研究
鉴别重组菌株。感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作。对细菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/mL。对于大多数E.coli来说，相当于 OD600为 0.4 左右，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中。有文献指出［1］，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为108细胞/mL的时候最适宜，有必要针对所使用的菌株确定其最佳转化条件。1 材料与方法1.1 材料1.
微生物学杂志 2013年1期2013-09-12
- 采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因
重悬，制备电转感受态细胞。取1μg p UCP－Red质粒电击转化PAO1感受态细胞，电击条件25μF、200Ω、2.5 k V。电击后菌液立即转入LB培养基中，180 r/min振摇2 h后，涂布含有羧苄青霉素（300μg/m L）的LB平板，37℃培养24 h～48 h挑取单菌落，采用PCR鉴定质粒是否成功转化（引物见表1）。1.4.2 PAO1lasB基因敲除株的构建1.4.2.1 线性打靶片段的制备 线性打靶片段的构建参照文献进行［7］。打靶片段前
中国人兽共患病学报 2013年2期2013-08-21
- 质粒pBV220-PTD-tCNTF转化BL21菌株感受态细胞的高效制备方法
改造菌株制作为感受态细胞，转入质粒pBV220-PTD-tCNTF，并探索其高效转化方法。感受态细胞的制备有很多方法，通常包括物理法和化学法。物理法即电转化法［7－8］，此种方法快速高效，但设备昂贵，技术要求高。化学法中最早也最为经典的是氯化钙法，这种方法由Mendel［9］建立于1970年，成为实验室制备感受细胞的一种常规技术，其后在此基础上有很多改进方法。一般认为缓冲液中的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可提高转化效率，PEG在浓度为10 g·L－1分子
中国药理学通报 2012年4期2012-02-10
- COX-2诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测
粒转化DH5α感受态细胞,挑取单克隆作为 PCR反应模板,用PCR的方法扩增出目的基因。引物设计如下：COX-2 F 5′-GG A ATT CAT GCT CGC CCG CGC CCT-3′;COX-2 R 5′-CGG G AT CCC TAC AGT TCA GTC GAA CGT TCT TTTAGT AGT ACT G-3′,分别在 5′端引入酶切位点EcoRⅠ和 BamHⅠ。反应总体积为 50μL,其中包括：COX-2 F 0.5μL,COX
首都医科大学学报 2011年1期2011-01-25