包涵体重组蛋白不同纯化方法的比较

常恒祯，常江，战俊澎，杨馨，郭珣，刘益辛，邹德颖，2，任洪林

1.吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室／动物医学学院／人兽共患病研究所，吉林长春130062；2.辽宁省盘锦检验检测中心，辽宁盘锦124000

目前应用最广泛的重组蛋白表达系统为E.coli原核表达［1］，但由于蛋白表达速度过快、不正确折叠或多肽链疏水区域间非特异性相互作用等原因［2］，该系统表达的蛋白多以无活性的包涵体形式存在，难以获取可溶性目的蛋白［3］。目前，多通过缩短表达时间及降低IPTG浓度来降低包涵体表达量［4］；另有研究在培养基中加入金属离子，或使用麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）标签等增加可溶性表达［5-6］。但这些方法均未达到理想效果，部分蛋白仍稳定表达于包涵体中，且表达量较低，另外，制备抗体不宜加入MBP标签蛋白，因其可能干扰目标蛋白的正确结构和功能［7］，且不保证可溶性蛋白正确折叠［8］。

因此，增加包涵体蛋白的表达量及纯化量显得尤为重要。本研究通过优化包涵体蛋白表达条件及对3种常用包涵体纯化方法（切胶、包涵体复性及Ni-NTA亲和层析纯化）进行比较，获得最佳表达及纯化方法，以期提高包涵体表达量及可溶性蛋白纯化量。

1 材料与方法

1.1 菌株及质粒 感受态E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）PLysS及E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL购自上海唯地生物技术有限公司；全长IL-1β与全长IL-1Ra重组质粒［9］（以下简称IL-1β-1Ra-2重组质粒）、全长IL-1Ra重组质粒由吉林大学人兽共患病细菌室保存。

1.2 主要试剂 IPTG购自北京博奥拓科技有限公司；KCl、NaH2PO4及Na2HPO4购自北京化工厂有限责任公司；EDTA、Tris、Urea购自广州赛囯生物科技有限公司；蛋白预染marker购自北京聚合美生物科技有限公司；BSA标准蛋白购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠抗His标签单克隆抗体购自北京义翘神州科技有限公司；PEG 20000购自北京索莱宝科技有限公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自美国Immunoway公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 包涵体复性纯化试剂 TE缓冲液：20 mmol／L Tris，1mmol／LEDTA，pH 8.5；洗涤缓冲液Ⅰ：20mmol／L Tris、1 mmol／L EDTA，1%TritonX-100，pH 8.5；洗涤缓冲液Ⅱ：20 mmol／L Tris，1 mmol／L EDTA，1%TritonX-100，2 mol／L Urea，pH 8.5；变性缓冲液：20mmol／LTris，10mmol／LEDTA，8mol／LUrea，pH 9.5；复性缓冲液Ⅰ~Ⅳ：2 mmol／L GSH，0.2 mmol／L GSSG，20 mmol／L Tris，等差数列依次加入6、4、2、0 mol／L Urea，pH均为9.5。

1.3.2 Ni-NTA亲和层析纯化试剂 Buffer A：2 mol／L Urea，20 mmol／L Tris，0.3 mol／L NaCl，1%Triton-X100，1 mmol／Lβ-巯基乙醇，pH 8.0；Buffer B~E：100 mmol／L NaH2PO4，10 mmol／L Tris·Cl、8 mol／L Urea（pH分别为：8.0、6.3、5.9、4.5）；平衡缓冲液：50 mmol／L NaH2PO4、300 mmol／L NaCl，10 mmol／L imidazole，pH 8.0。

1.4 包涵体蛋白表达条件的优化

1.4.1 感受态菌株 将10μLIL-1β-1Ra-2重组质粒和全长IL-1Ra重组质粒分别转化至感受态E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）PLysS及E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL中，涂布于含卡那霉素（100μg／mL）的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中培养8 h；挑取单菌落，接种于含卡那霉素（100μg／mL）的LB液体培养基中，于37℃，165 r／min振荡培养至A600约为0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol／L，继续培养8 h，进行15%SDS-PAGE分析，同时以未诱导菌为对照。

1.4.2 IPTG诱导浓度 将10μL IL-1β-1Ra-2重组质粒和全长IL-1Ra重组质粒分别转化至感受态E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL，涂布于含卡那霉素（100μg／mL）的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中培养8 h；挑取单菌落，接种于含卡那霉素（100μg／mL）的LB液体培养基中，于37℃，165 r／min振荡培养至A600约为0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol／L，继续培养8 h，进行15%SDS-PAGE分析。

1.4.3 诱导温度 将10μL IL-1β-1Ra-2重组质粒和全长IL-1Ra重组质粒分别转化至感受态E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL，涂布于含卡那霉素（100μg／mL）的LB固体培养基，于37℃恒温培养箱中培养8 h；挑取单菌落，接种于含卡那霉素（100μg／mL）的LB液体培养基中，于37℃，165 r／min振荡培养至A600约为0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol／L，分别于16和37℃，165 r／min培养8 h；取2 mL菌液，于4℃，13 460×g离心2 min，收集菌体，超声破碎，分别收集上清和沉淀，进行15%SDS-PAGE分析。

1.5 包涵体蛋白的纯化 采用最佳蛋白表达条件对IL-1β-1Ra-2重组质粒进行诱导表达，当菌液A600达0.8时，收菌，进行蛋白纯化。

1.5.1 切胶纯化 菌体经15%SDS-PAGE分离后，将蛋白胶加入0.25 mol／L KCl溶液至完全浸泡，4℃反应5 min，切下目的条带放入透析袋，加常规电泳液至完全浸泡目的条带，密封，置放有冰水混合物的电泳槽中，于70 V电压下作用2 h；置4℃，0.01 mol／L的PBS中透析6 h；4℃，6 080×g离心30 min，取上清，进行15%SDS-PAGE分析。

1.5.2 包涵体复性纯化 用0.01 mol／L的PBS将菌体沉淀洗涤3次，按菌体湿重与TE缓冲液1∶80（质量 ∶体积）的比例加入TE缓冲液，充分混匀，超声破碎，收集包涵体沉淀。将包涵体湿重与洗涤缓冲液Ⅰ按1∶50（质量 ∶体积）的比例加入洗涤缓冲液Ⅰ，于室温，200 r／min搅拌洗涤2 h；4℃，6 080×g离心40 min，收集包涵体沉淀（重复该步骤1次）；相同条件下采用洗涤缓冲液Ⅱ洗涤包涵体1次，溶解于变性缓冲液中，于室温下120 r／min搅拌过夜；25℃，6 080×g离心30 min，收集上清，即变性包涵体。将变性包涵体装入透析袋中，依次浸入复性缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中进行复性（变性液与复性缓冲液的体积比为1∶100），于4℃层析柜中缓慢搅拌，每次透析6~12 h；再置0.01 mol／L的PBS缓冲液（pH 7.4）中透析6 h；4℃，6 080×g离心30 min，取上清。取各步骤样品进行15%SDS-PAGE分析。

1.5.3 Ni-NTA亲和层析纯化 收集沉淀，按每克菌体湿重加入80 mL Buffer A重悬，超声破碎，收集包涵体沉淀；用30 mLBuffer A洗涤2次，6 080×g离心30 min；收集包涵体沉淀，按每克湿重加入50 mL Buffer B，室温涡旋溶解2 h（或缓慢搅拌过夜）至溶液为半透明；25℃，6 080×g离心30 min，取上清液。将镍柱用5~10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱体，待流穿后，加入4倍柱体积的上清液，于室温，200 r／min混合1~2 h；流穿后分别用4倍柱体积Buffer C洗涤2次、0.5倍柱体积Buffer D洗脱4次、0.5倍柱体积Buffer E洗脱4次；收集洗脱液，于含6~0 mol／L Urea的Tris缓冲液中透析6~12 h，再置0.01 mol／L的PBS中透析6 h；4℃，6 080×g离心30 min，取上清。取各步骤样品进行15%SDS-PAGE分析。

1.6 纯化方法的验证 采用最佳蛋白表达条件对IL-1β-1Ra-2重组质粒和全长IL-1Ra重组质粒进行诱导表达，当菌液A600达0.8时，收菌，采用最佳纯化方法进行纯化。通过Bradford法测定蛋白浓度，计算蛋白量。纯化产物经15%SDS-PAGE分离蛋白后，转移至PVDF膜，用5%脱脂奶于4℃封闭12 h；加入小鼠抗His标签单克隆抗体（1∶2 000稀释），于37℃孵育1 h；用PBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1∶4 000稀释），用PBST洗涤4次，ECL法显色。

2 结果

2.1 最佳蛋白表达条件

2.1.1 感受态菌株 IL-1β-1Ra-2重组质粒转化感受态E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL后可见相对分子质量约10 560的目的蛋白条带，大小与预期相符，转化其他两种感受态菌株后均未见该目的蛋白条带；全长IL-1Ra重组质粒转化3种感受态菌株后可见相对分子质量约19 770的目的蛋白条带，大小与预期相符。见图1（全长IL-1Ra重组质粒以感受态E.coli BL21-Codon Plu（sDE3）-RIPL为例，其他略）。因此确定采用感受态E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL进行后续试验。

图1 转化感受态菌株的优化Fig.1 Optimization of competent strains

2.1.2 IPTG终浓度 经不同IPTG终浓度诱导的IL-1β-1Ra-2重组蛋白及IL-1Ra重组蛋白产物均可见相对分子质量约10 560和19 770的目的蛋白条带，大小与预期相符。当IPTG终浓度为1 mmol／L时，IL-1β-1Ra-2重组蛋白表达量最高；IPTG终浓度为0.4 mmol／L时，IL-1Ra重组蛋白的表达量最高。见图2。因此，确定IL-1β-1Ra-2重组质粒及全长IL-1Ra重组质粒最佳IPTG终浓度分别为1和0.4 mmol／L。

图2 IPTG终浓度的优化Fig.2 Optimal of final concentration of IPTG

2.1.3 诱导温度 IL-1β-1Ra-2重组质粒于16℃诱导时，未表达；37℃诱导时，可见相对分子质量约10 560的目的蛋白条带，大小与预期相符，于包涵体中表达；全长IL-1Ra重组质粒于16及37℃诱导时，均可见相对分子质量约19 770的目的蛋白条带，大小与预期相符，可稳定表达于包涵体中，37℃的表达量更高。见图3。因此确定IL-1β-1Ra-2重组质粒及全长IL-1Ra重组质粒最佳诱导时间均为37℃。

图3 诱导温度的优化Fig.3 Optimization of temperature for induction

2.2 包涵体的纯化

2.2.1 切胶纯化 切胶纯化浓度极低，浓缩后才可见相对分子质量约10 560的目的蛋白条带，大小与预期相符，纯化回收量约为5.1 mg。由于蛋白回收量过少，条带颜色较浅，见图4。因此，切胶纯化法不适用于大批量生产。

图4 切胶纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified product by gel cutting

2.2.2 包涵体复性纯化 包涵体变性、复性及纯化产物中均可见相对分子质量约为10 560的目的蛋白条带，大小与预期相符，见图5。表明洗涤过程中未过多消耗目的蛋白，且能去除90%以上的杂带。目的蛋白于变性缓冲液中溶解率可达85%以上，纯化后蛋白纯化回收量约为46 mg。

图5 包涵体复性纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of renaturalized and purified products

2.2.3 Ni-NTA亲和层析纯化 包涵体溶解后可见相对分子质量约为10 560的目的蛋白条带，大小与预期相符；流穿后洗脱，目的蛋白回收量较低，约为1.2 mg。见图6。

图6 Ni-NTA亲和层析纯化产物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified product by Ni-NTA affinity chromatography

综上所述，包涵体复性纯化蛋白回收量最高，因此选择包涵体复性纯化作为最佳纯化方法。

2.3 纯化方法的验证 IL-1β-1Ra-2重组蛋白及全长IL-1Ra重组蛋白包涵体复性纯化产物于相对分质量约10 560和19 770可见目的蛋白条带，且几乎无杂带，纯度可达90%以上，可溶性蛋白回收量分别约为46及63 mg，见图7；且均可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合，且于相对分子质量约10 560和19 770处可见特异性结合条带，见图8。图中未诱导组出现较弱条带，是目的蛋白在未诱导条件下的本底表达。

图7 最佳方法纯化产物的SDS-PSGE分析Fig.7 SDS-PAGE profile of purified product by optimal method

图8 最佳方法纯化产物的Western blot检测Fig.8 Western blotting of purified product by optimal method

3 讨论

感受态E.coli BL21（DE3）pLysS相较于E.coli BL21（DE3）具有降低目的基因背景表达水平的特点，但对IPTG诱导表达无明显影响。感受态E.coliBL21-Codon Plus（DE3）-RIPL与E.coli BL21（DE3）pLysS及E.coli BL21（DE3）比较，具有减少重组蛋白的降解、提高外源基因在原核系统中表达水平等特点，更利于非高表达重组蛋白的诱导表达。本实验结果表明，感受态E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL可改善相对分子质量约10 000的重组蛋白难以在E.coli中稳定表达，需融合表达至大型蛋白（如MBP和GST）后才可稳定表达［10］的问题，并可获得更高产量［11］。

本研究对3种常用包涵体纯化方法进行了比较。在切胶纯化方法中，根据目的蛋白大小及其表达量，选择可游离出目的蛋白的最适电压和反应时间，但蛋白可溶性回收量较低，若以变、复性增加回收目的蛋白的可溶性，则失去其高效、成本低等特点。有文献表明，KCl染色切胶纯化法不适用于纯化低表达量蛋白［12］，与本实验结果一致。本实验Ni-NTA亲和层析纯化中，蛋白纯化采用变性后过镍柱再复性的方法，但洗脱后回收量较低，与王晓娟［13］的实验结果一致。这可能与溶解缓冲液pH及溶解效果欠佳等有关，也可能与蛋白表达量较低、相对分子质量较小有关。Ni-NTA亲和层析纯化法中的Buffer B与包涵体复性纯化法中的变性缓冲液同用于包涵体的溶解，通过两者对比发现，不易与重金属离子发生沉淀的TE缓冲液溶解效果明显优于磷酸盐缓冲液。在包涵体纯化过程中，有些蛋白的活性状态需要有金属离子，而有些蛋白含有半胱氨酸（如IL-1β-1Ra-2重组蛋白），应添加EDTA，减少金属离子，以保证游离巯基活性［14］，从而减少沉淀的发生。包涵体复性纯化中，通过前期多次大量纯化，发现蛋白纯度的高低主要取决于洗涤缓冲液Ⅰ和洗涤缓冲液Ⅱ各自洗涤的时间和次数，对于高表达量的蛋白应适当增加洗涤次数。不稳定的蛋白质可加入适量甘油，增加复性时的重折叠率［15］。另外，正确的半胱氨酸残基自发结合需要弱氧化条件，但非正确状态下则需要更强的氧化条件（如比率为10∶1的GSH∶GSSG）来达到最佳的天然构象［16］。本实验通过包涵体复性纯化法复性后，蛋白重折叠效果良好，无过多沉淀析出。

综上所述，在相同表达条件下，包涵体复性纯化法优于Ni-NTA亲和层析和切胶纯化法，更易获得高纯度和高回收量的可溶性蛋白，适用于相对分子质量约10 000的非高表达包涵体蛋白的纯化。