丙戊酸钠和锌离子对C HO工程细胞抗体产量的影响

宋瑞卿，苏杭，张玲，张路明，马宁宁

沈阳药科大学无涯学院，辽宁沈阳110016

单克隆抗体（简称单抗）广泛应用于疾病诊断和治疗领域，具有重要的社会价值和经济价值。由于治疗性单抗需求量大、表达量低，优化其生产工艺、提高抗体产量显得尤为迫切，而优化流加补料培养工艺是提高抗体产量的重要途径。

研究表明，CHO工程细胞株培养过程中添加丁酸盐可提高抗体产量［1-3］，但丁酸盐会诱导CHO细胞凋亡、抑制细胞生长、降低细胞活性［3-5］。丙戊酸盐是丁酸盐的类似物，有研究表明［6-11］，在提高抗体产量方面，丙戊酸钠比丁酸钠具有明显优势，但对细胞生长仍有负面影响。氨基酸类、维生素类、金属离子、4-氨基苯甲酸对细胞生长及抗体产量提高具有一定的促进作用，细胞培养过程中添加这些物质可减弱丙戊酸钠对细胞生长抑制的影响。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是细胞生命活动重要的氮源，细胞悬浮培养过程中，往往通过调节培养基中不同氨基酸含量，来满足细胞生长过程对氨基酸的偏好［12-13］。金属离子如二价锌、铁、铜是维持细胞生长和生理活性的重要物质，在细胞合成与代谢过程中发挥重要作用，其中锌离子作为细胞培养过程中重要的微量元素，可调节细胞内代谢酶的活性，影响细胞分裂增殖、信号转导等生理生化过程［14］。在动物细胞无蛋白悬浮培养过程中，可通过加入锌离子替代胰岛素［15］。另有文献报道，锌离子还具有提高细胞活性，促进细胞生长，减缓细胞凋亡，提高抗体产量的作用［16-17］。

本实验以表达贝伐珠单抗的CHO工程细胞株为研究对象，考察流加补料培养工艺中丙戊酸钠对抗体产量的影响，并对氨基酸类、维生素类、金属离子等进行初步筛选，再通过单因素试验确定锌离子的最佳浓度，并采用中心复合试验设计（central composite design，CCD）法对丙戊酸钠、锌离子的组合使用进行分析。

1 材料与方法

1.1 细胞 表达贝伐珠单抗的CHO工程细胞株由沈阳药科大学本溪实验室提供。

1.2 主要试剂及仪器 CD-CHOK1培养基和CHO NF603补料液购自壹生科（深圳）有限公司；ELISA试剂盒购自英国Bethyl Laboratories公司；蛋氨酸亚氨基代砜（methionine sulfoximine，MSX）、葡萄糖、台盼蓝、硫酸锌、丙戊酸钠、酪氨酸、支链氨基酸、精氨酸、维生素B6、维生素C、硫酸铜和柠檬酸铁均购自美国Sigma-Aldrich公司；Countstar自动细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司；多功能酶标仪购自奥地利TECAN公司；MilliQ纯水器购自美国Miliipore公司。

1.3 流加补料培养 将CHO工程细胞株复苏传代，待细胞生长稳定后，按0.5×106个／mL的密度接种至100 mL培养瓶中，培养体系为20 mL，置37℃，8%CO2培养箱中培养，摇床转速为120 r／min。培养3 d后，用Countstar自动细胞计数仪检测活细胞密度和细胞活率，并进行流加补料培养，补料条件为：CHO NF603补料液3%／24 h；葡萄糖：2 g／（L·24 h）。培养至第13天，取培养上清，采用ELISA法检测上清中抗体产量。

1.4 丙戊酸钠对C H O工程细胞生长及抗体产量影响的检测 细胞培养第8天开始添加不同浓度的丙戊酸钠（0、1、1.5、2、2.5 mmol／L），以0 mmol／L丙戊酸钠组作为对照组，按1.3项方法检测活细胞密度、细胞活率和抗体产量。

1.5 流加物质对C H O工程细胞生长及抗体产量影响的检测 细胞培养第3天开始，每24 h分别添加氨基酸类、维生素类、金属离子、4-氨基苯甲酸，以未加上述物质作为对照组，检测细胞生长状态和抗体产量。

1.6 锌离子浓度的筛选 细胞培养第3天开始，每24 h添加不同终浓度的锌离子（0、45、90、135、180μmol／L），以0μmol／L锌离子组作为对照组，检测活细胞密度、细胞活率和抗体产量。

1.7 两因素交互作用考察 为了进一步考察丙戊酸钠、锌离子同时加入对抗体产量的影响，利用Minitab 17软件的试验设计功能对工艺进一步优化。通过1.4和1.6项单因素试验结果可知，丙戊酸钠终浓度在1.0～2.5 mmol／L范围内、流加物锌离子终浓度在45～135μmol／L范围内对抗体产量有较大影响，采用中心复合试验设计寻找其最优参数，从而提高抗体产量。将丙戊酸钠终浓度和锌离子终浓度2个因子分别编码为X1、X2，响应值为抗体产量Y。在2个因素的情况下，应取α=1.414，则星号臂长为1.414，每个因子的低、中、高水平分别记作-1、0、1，轴向延伸点分别记作-1.414、+1.414，为使设计结果和推测出的最佳点均较可信，决定在中心点处进行5次试验，则试验次数为13。各自变量水平见表1，试验设计见表2。

表1 中心复合设计因素水平表Tab.1 Factors and levels of central composite design

表2 中心复合设计试验设计表Tab.2 Experimental design of central composite design

借助Minitab 17软件中的回归拟合，为响应值拟合单独的模型，得到响应值与自变量的回归方程，方程中的自变量使用编码制数值，二次多项式模型与数据的拟合程度用系数R2表示。利用Minitab 17软件中响应曲面的相关分析得到响应曲面图和等值线图，图中两个因子对应的坐标轴均为编码制数值。利用Minitab 17软件中的响应优化器获得最优值，本实验中设计目标为最大化，权重和重要度均为1。

1.8 验证试验 为了验证模型对这两个因子的优化效果，根据上述试验设计获得的因子最优水平值进行5次重复试验。

2 结果

2.1 丙戊酸钠对C H O工程细胞生长及抗体产量影响 试验结果显示，各浓度丙戊酸钠组活细胞密度及细胞活率较对照组均有不同程度降低，见图1；抗体产量均高于对照组，其中丙戊酸钠终浓度为1.5 mmol／L时，抗体产量最高，为（2 115.2±113.6）mg／L，比对照组提高了（81.5±9.7）%，见图2。表明丙戊酸钠对CHO细胞生长具有一定的抑制作用，可能限制其提高抗体产量的潜力。

图1 不同浓度丙戊酸钠对CHO工程细胞活细胞密度（A）及细胞活率（B）的影响Fig.1 Effect of sodium valproate at various concentrations on density（A）and survival rate（B）of engineered CHOcells

图2 不同浓度丙戊酸钠对CHO工程细胞抗体产量（A）及产量增长百分比（B）的影响Fig.2 Effect of sodium valproate at various concentrations on production（A）and increasing percentage（B）of antibody in engineered CHO cells

2.2 流加物质对C H O工程细胞生长及抗体产量的影响 试验结果显示，锌离子对促进CHO工程细胞生长及提高抗体产量的作用较显著，见表3。

表3 流加物质的初步筛选结果Tab.3 Preliminary screening of additives for fed batch

2.3 锌离子浓度的筛选 试验结果显示，各浓度锌离子组CHO工程细胞的最高活细胞密度均高于对照组，其中锌离子终浓度为90μmol／L时，最高活细胞密度最大，见图3。各浓度锌离子组CHO工程细胞的抗体产量均高于对照组，其中锌离子终浓度为90μmol／L时，抗体产量最高，为（1 640.2±93.1）mg／L，比对照组提高了（38.3±4.3）%，见图4。

图3 不同终浓度锌离子对CHO工程细胞活细胞密度（A）及细胞活率（B）的影响Fig.3 Effect of zinc ion at various concentrations on density（A）and survival rate（B）of engineered CHOcells

图4 不同终浓度锌离子对CHO工程细胞抗体产量（A）及产量增长百分比（B）的影响Fig.4 Effect of zinc ion at various concentrations on production（A）and increasing percentage（B）of antibody in engineered CHO cells

2.4 两因素交互作用考察

中心复合设计13次试验抗体产量分别为2 697、2 667、2 302、2 258、2 701、2 534、2 705、1 915、2 141、2 395、2 292、2 144和2 676 mg／L。

2.4.1 回归拟合分析 响应值与自变量的回归方程为：Y=2 689.2+87.5 X1+34.7 X2-295.4 X12-146.2 X22+100.0 X1X2，R2=0.949。表明二次多项式回归效果较好，此模型近似地拟合于真实情况，且预测值与实测值之间具有高度相关性。

2.4.2响应曲面图和等值线图 响应曲面图见图5，等值线图见图6。由两图可以看出，在所考察两因子的水平范围内，响应值（抗体产量）存在最大值，同时响应值与丙戊酸钠、锌离子终浓度存在显著相关性，且丙戊酸钠和锌离子之间的交互作用也较明显。

图5 抗体产量响应曲面图Fig.5 Response surface plot of antibody production

图6 抗体产量等值线图Fig.6 Contour plot of antibody production

2.4.3 求取最优值 分析可得，当编码制X1=0.1857，X2=0.185 7时，多项式回归方程取得最大值，对应的未编码的实际值为X1=1.1mmol／L，X2=98.4μmol／L，此时响应值最大，为Ymax=2 700.1 mg／L。

2.5 验证试验 在利用中心复合试验设计得到两个因子最优水平的条件下，重复5次试验所得的抗体产量（Y）与模型拟合所得最大抗体产量的相对误差均小于2.0%，平均相对误差为0.46%，见表4，表明模型预测值与实际值非常相近，且试验稳定性较好，具有可重复性。5个批次的抗体平均产量为2 687.2 mg／L，但在只加入丙戊酸钠时，抗体产量最高为2115.2mg／L，相比之下，抗体产量提高了27.0%；在只加入锌离子时，抗体产量最高为1 640.2 mg／L，相比之下，抗体产量提高了63.8%，表明丙戊酸钠和锌离子同时加入可进一步提高抗体产量。

表4 验证试验结果Tab.4 Result of verification test

3 讨论

本研究考察了CHO工程细胞培养过程中丙戊酸钠对细胞株抗体产量的影响。丙戊酸钠流加试验表明，细胞培养第8天单次添加终浓度为1.5 mmol／L的丙戊酸钠对抗体产量提高作用最为明显。有文献报道，丙戊酸钠对细胞也有一定的毒副作用［14］，因此选择活细胞总数开始下降的时间点加入丙戊酸钠，避免过早抑制细胞生长，影响抗体产量。为降低丙戊酸钠对细胞生长的不良影响，尝试通过流加氨基酸类、维生素类、金属离子类等物质弥补丙戊酸钠对细胞生长带来的负面作用，这些物质对细胞生长及抗体产量提高具有一定的促进作用。通过对流加物质初步筛选得出，锌离子可促进细胞生长，且对提高抗体产量作用较明显。锌离子流加试验表明，细胞培养第3天开始，每24 h添加锌离子，对细胞生长具有促进作用，当添加的锌离子终浓度为90μmol／L时，对抗体产量的提高作用最为明显，表明锌离子可增加CHO工程细胞株的抗体产量。根据上述试验结果，进一步研究丙戊酸钠、锌离子组合使用对CHO工程细胞抗体产量的影响。采用Minitab 17软件，通过中心复合试验设计得到这两个因子的最优水平，并对最优水平值X1=1.1 mmol／L，X2=98.4μmol／L进行5次重复试验。重复试验所得的抗体产量（Y）与模型拟合所得最大抗体产量的相对误差均小于2.0%，平均相对误差为0.46%，表明模型预测值与实际值非常相近，且试验稳定性较好，具有可重复性。

综上所述，本研究结果表明，组合使用丙戊酸钠、锌离子对抗体产量提高的比例明显优于单独使用，可能是丙戊酸钠促进抗体表达的同时抑制细胞生长，限制其提高抗体产量的潜力，锌离子的加入可减弱丙戊酸钠对细胞生长的影响，组合使用可更高效地表达抗体。