A型肉毒梭菌培养基中植物水解蛋白替代胰酪蛋白胨的可行性分析

王云天，陈苏玲，苗承辉，陆俭，李晨昊，何星

兰州生物技术开发有限公司毒素制剂室，甘肃兰州730046

肉毒梭菌是一种能形成芽胞的革兰阳性厌氧菌，可产生A~G 7种不同的神经毒素［1］。A型肉毒毒素广泛应用于医疗和美容行业［2］，其原理是A型肉毒毒素阻断神经传导的乙酰胆碱受体，导致神经信号不能传导而引起肌肉松弛［3-4］。兰州生物技术开发有限公司生产的注射用A型肉毒毒素（商品名：衡力®）是我国批准上市，以治疗和美容为目的的唯一国内产品［5］，是由产毒较高的A型肉毒梭菌Hall株经产毒培养、纯化等一系列生产过程制备，在产毒培养阶段，培养基中的有机氮源是用动物源性的胰酪蛋白胨提供的。为避免在A型肉毒毒素产品中引入其他外源性病毒的隐患，考虑用植物水解蛋白（tryptonesubstitute，TS）替代。TS是非动物源性（aminalorigin free，AOF）氮源，与胰酪蛋白胨相比，其相对分子质量较小，易于被细菌生长所吸收，且其碳水化合物总量较高，能在细菌生长后期提供更多的营养物质来源［6］，是动物源性有机氮源的可能替代物。本文对以TS作为主要成分的培养基所培养的A型肉毒梭菌的产毒力以及生产的收获物进行研究，分析TS替代胰酪蛋白胨的可行性。

1 材料与方法

1.1 菌株 A型肉毒梭菌Hall株由美国威斯康辛大学食品研究所1984年惠赠，现保存于兰州生物技术开发有限公司菌种库。

1.2 培养基 TYG（胰酪蛋白胨-酵母浸出粉-葡萄糖）培养基由兰州生物技术开发有限公司毒素制剂室2015年制备，批号分别为20150101、20150302、20150403、20150504、20150605、20150906、20151007。

1.3 主要试剂及仪器 胰酪蛋白胨和酵母浸出粉购自英国OXOID公司；葡萄糖购自山东祥瑞药业有限公司；TS购自美国UNITED STATESBIOLOGICAL公司；Thermo6000系列培养箱购自美国THERMO公司；HI123台式酸度测定仪购自美国汉娜公司；UV-1206型分光光度计购自日本岛津公司。

1.4 实验动物及毒力测定方法 SPF级昆明小鼠，雌性，26~30日龄，由兰州生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供，动物使用许可证号：SYXK（甘2012-0001）。培养基产毒力测定方法是采用尾静脉注射的方法（Broff法）［7］，用IV（intravenous injection）毒力表示；收获物检定时毒力测定方法是采用腹腔注射的方法［7］，用IP（intraperitoneal injection）毒力表示。

1.5 收获物检定方法 吸光度比值：样品在260和280 nm波长处的吸光度的比值（A260／A280）；蛋白浓度：A280／1.66［8］；纯度：IP毒力 ／蛋白浓度；蛋白质图谱：SDS-PAGE法（4%~12%梯度胶）检测结晶毒素的蛋白组成［7］。

1.6 培养基T S浓度的筛选试验

1.6.1 产毒力筛选试验 其他成分浓度不变，分别配制TS浓度为3%、4%、5%、6%、7%的培养基于血浆瓶中，250 mL／瓶，115℃，30 min灭菌处理后，接种A型肉毒梭菌，于35℃培养120 h，测定培养液产毒力是否≥1×105LD50／mL（A型肉毒梭菌产毒力内控标准）［7］。试验重复3次。

1.6.2 纯化筛选试验 按1.6.1项结果选择培养基产毒力平均值最高的3种TS浓度，培养基其他成分浓度不变，分别配制3种TS浓度的培养基，各1瓶，9 000 mL／瓶，115℃，30 min灭菌处理后，接种A型肉毒梭菌，于35℃培养120 h。测定培养液产毒力后，采用注射用A型肉毒毒素的生产工艺对培养液进行纯化，对比纯化结果，筛选出适合生产工艺的TS浓度。

1.7 T S YG（植物水解蛋白-酵母浸出粉-葡萄糖）培养基放大培养试验

1.7.1 正常生产规模的产毒力试验 选择1.6.2项筛选的最佳TS浓度制备3批培养基，批号分别为试20150101、试20150502和试20151103，每批培养基总量为27 000 mL，分装于立瓶，9 000 mL／瓶，共3瓶，115℃，30 min灭菌处理后，接种A型肉毒梭菌，于35℃培养120 h。测定培养液产毒力，确认放大至生产规模后产毒力是否 ≥1×105LD50／mL，并与TYG培养基的产毒力效果进行比较。

1.7.2 TSYG培养基收获物检定 用3批（试2015-0101、试20150502和试20151103）TSYG培养基生产的收获物，采用注射用A型肉毒毒素的生产工艺。收获物对应批号为试H-20150101、试H-20150502和试H-20151103。检测收获物的质控参数结晶毒素收率、IP毒力、吸光度比值、纯度和蛋白质图谱是否符合质控标准［7］。

1.8 T S YG与TYG培养基生产的收获物的关键质控参数的对比 对3批（试20150101、试20150502和试20151103）TSYG培养基生产的收获物（对应批号分别为试H-20150101、试H-20150502、试H-2015-1103）及7批（20150101、20150302、20150403、20150-504、20150605、20150906、20151007）TYG培养基生产的收获物（对应批号分别为H-20150101、H-2015-0302、H-20150403、H-20150504、H-20150605、H-201-50906、H-20151007），进行关键质控参数结晶毒素收率和纯度的分析。

1.9 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，成组t检验方法分析不同培养基的产毒力以及收获物的关键质控参数结晶毒素收率和纯度，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养基T S浓度的筛选

2.1.1 产毒力筛选 TS浓度为3%、4%、5%、6%、7%的培养液，IV毒力均≥1×105LD50／mL，符合培养基产毒力要求，见表1。选择产毒力结果平均值较高的3%、4%和5%3个TS浓度进行下一步纯化筛选。

表1 产毒力筛选试验结果（×105 LD50／mL）Tab.1 Screening of toxigenic capacity（×105 LD50／mL）

2.1.2 纯化筛选 3种TS浓度的培养液IV毒力均≥1×105LD50／mL，TS浓度5%的培养液IV毒力为9.80×105LD50／mL，高于另外2种浓度。纯化过程中，TS浓度3%的培养液在提取-离心阶段固液未分，导致纯化不能继续，废弃；TS浓度4%和5%的培养液纯化结果均符合质控标准。TS浓度5%的培养液产毒力及纯化的关键质控参数（纯度和蛋白收率）均优于TS浓度4%的培养液，因此选择5%作为放大培养的TS浓度。见表2。

表2 不同TS浓度培养液纯化结果Tab.2 Purification of toxin produced by culture medium at various TSconcentrations

2.2 T S YG培养基放大培养 3批放大至正常生产量的TSYG培养基，经产毒培养后，IV毒力均≥1×105LD50／mL，符合培养基产毒力质控标准。TSYG培养基与TYG培养基产毒力差异无统计学意义（t=0.529，P=0.615），见表3，表明TSYG培养基的产毒效果不低于TYG培养基。

表3 TSYG培养基与TYG培养基产毒力对比Tab.3 Comparison of toxigenic capacities of TSYGand TYGculture media

2.3 T S YG培养基生产的收获物的检定结果 3批TSYG培养基生产的收获物的结晶毒素收率均在0.8~7.0 mg／L之间，吸光度比值均 ＜0.60，IP毒力均 ＞1.00×106LD50／mL，纯度均 ＞1.00×107LD50／mg，均符合质控标准；在非还原和还原条件下电泳图谱均与参考品一致。见表4和图1。3批TSYG培养基生产的收获物的检定结果全部符合要求。

图1 结晶毒素SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE profile of crystal toxin

表4 TSYG培养基生产的收获物的各项指标检测结果Tab.4 Quality indexes of toxin produced by TSYG medium

2.4 T S YG与TYG培养基生产的收获物的关键质控参数对比结果 TSYG与TYG培养基生产的收获物的结晶毒素收率、纯度差异均无统计学意义（t分别为1.424和-1.513，P分别为0.178和0.154），见表5。表明TSYG培养基生产的收获物质量并不低于TYG培养基生产的收获物。

表5 TSYG与TYG培养基生产的收获物的关键参数对比Tab.5 Comparison of main parameters of toxin produced by TSYGand TYGculture media

3 讨论

在A型肉毒梭菌的产毒培养过程中，培养基的作用是为细菌生长提供充足的营养。对注射用A型肉毒毒素制品而言，不但需要培养基产毒力符合要求，而且残留物也不能对纯化产生影响，能够用现有工艺生产出符合要求的结晶毒素。

本研究用TS配制的培养基接种肉毒梭菌后，在培养过程中，细菌生长良好，产气旺盛，产毒力符合《中国药典》三部（2015版）［7］规定的标准，与胰酪蛋白胨培养基培养A型肉毒梭菌相比无差异性。

原液检定的重要指标是纯度及蛋白含量，纯度决定了成品中A型肉毒毒素的实际蛋白含量，人体使用纯度不高的产品会导致抗体产生，而原液的纯度也得益于培养收获物中的毒素含量和纯度。虽然目前没有文献证明A型肉毒毒素制品注射到人体内有抗体产生，但为了降低风险，兰州生物技术开发有限公司生产原液所选用的培养收获物毒素含量均在3.0×107LD50／mg以上，本次实验中批号为试H-20150502的收获物纯度为3.79×107LD50／mg，完全符合生产原液的标准。

3批TSYG培养液经现有工艺纯化，纯化过程各项参数与现行生产工艺基本无差异，其收获物的检定结果也均符合《中国药典》三部（2015版）［7］规定的A型肉毒毒素收获物质控标准。因此可以确定，用TS替代胰酪蛋白胨是可行的。