嗜热链球菌的电转化条件

洛雪，时旭，史海粟，杜阿楠，陈茜，乌日娜，武俊瑞

(沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳，110866)

乳酸菌属于革兰氏阳性菌，微好氧，能够发酵碳水化合物生产乳酸，通常乳酸菌基因组中G+C含量较低，它与人类有密切的关系，是人类正常肠道菌群的组成成分，如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、罗氏菌属(Rothia)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)和明串珠菌属(Leuconoostoc)等[1-2]。其中部分乳酸菌及其发酵产物有一定的生理功能，能够调节肠道微生态平衡、调节免疫功能、降低胆固醇、抑制有害菌生长等。并且它还能赋予发酵食品特有的滋气味和质感[3-4]，因此近年来乳酸菌成为研究的热点，随着分子生物学技术的发展，诸多的乳酸菌全基因组(S.thermophilus、Lactococcuslactis、Lactobacillusacidophilus、Lactobacillusplantarun等[5-6])逐步测序成功，成为模式生物，基因工程改造的乳酸菌逐渐应用于食品工业、医药、保健品和饲料等行业[7]。前期乳酸菌的研究主要集中在菌群结构及多样性分析[8-9]、益生菌资源的挖掘[10-11]、优化乳酸菌及其产物的发酵条件等[12-13]。20世纪后期，研究人员开始研究乳酸菌基因功能、生物学特性及其代谢产物产生的分子机制。研究人员开始将外源基因转入乳酸菌中，提升乳酸菌的益生性能[14]，但由于乳酸菌细胞壁紧致、厚密，外源DNA很难进入受体细胞，故而转化效率极低[15-16]，严重制约了乳酸菌分子生物学的研究和基因工程技术的发展[17-18]。目前应用最广泛的乳酸菌转化外源DNA的方法是电转化法(electrotransformation)[19-20]，该方法将乳酸菌放入到外加电场中，电流作用细胞壁和细胞膜表面产生微小通道，由于电导率和通透性发生变化，外源DNA可以进入细胞内[21]，当电场消失后，乳酸菌经过富集培养，微小通道会消失，不会对细菌产生很大影响[22-23]。本研究选择乳酸菌组成型质粒pMG36e作为载体，该质粒已是一款成熟的表达载体[24]，研究甘氨酸浓度、菌体生物量、电极缓冲液、电压和质粒浓度对嗜热链球菌转化效率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜热链球菌sp1.1：本实验室前期同学分离自内蒙地区发酵乳制品，后经鉴定为嗜热链球菌。

pMG36e质粒：本实验室保藏。

甘油、甘氨酸、红霉素、蔗糖、柠檬酸铵、MgCl2、KH2PO4、K2HPO4等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

Gene Pilser Xcell电转仪，美国BIO-RAD公司；MILLI-Q超纯水仪，美国Millipore公司；BS124S万分之一分析天平，北京赛多利斯公司；PB-10精密酸度计，北京赛多利斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红霉素杀伤曲线

将冻干或甘油冷冻保存的S.thermophilussp1.1纯化三代，进行纯培养，挑取单菌落接种于M17液体培养基，37 ℃培养24 h。制备不同浓度的红霉素平板(红霉素质量浓度5～30 μg/mL)。

1.3.2 甘氨酸对S.thermophilus感受态细胞的影响

按1%的接种量将S.thermophilussp1.1接入含有不同浓度甘氨酸的培养基(甘氨酸质量浓度为0、10、20、30、40、50 g/L)中进行培养，测定其12 h的生长曲线，以甘氨酸0 g/L的为对照。

1.3.3 菌体生物量对电转化率的影响

按1%接种量将S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液体培养基中，37 ℃培养，收集OD600为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0的菌体，制备S.thermophilus感受态细胞。

混合质粒与感受态细胞，冰浴，用电穿孔仪进行电击，电击结束后37 ℃温育复苏培养，将复苏后菌液涂布在红霉素抗性平板上，37 ℃静置培养48～72 h，比较不同菌体生物量对电转化率的影响。阴性对照为不加质粒的感受态细胞。

1.3.4 电极缓冲液对电转化率的影响

按1%接种量将S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液体培养基中，37 ℃培养，收集OD600为0.8的菌体，比较不同电转缓冲液 Ⅰ(0.5 mol/L蔗糖，1.0 mol/L MgCl2，1.0 mmol/L KH2PO4/K2HPO4；pH 7.4)、Ⅱ(0.5 mol/L蔗糖，1 mmol/L柠檬酸铵；pH 6.0)、Ⅲ(272 mmol/L蔗糖，150 g/L甘油)、Ⅳ(272 mmol/L蔗糖，100 g/L甘油，10 mmol/L磷酸盐缓冲液；pH 7.4)和100 g/L甘油电转缓冲液对电转化率的影响结果，感受态细胞具体制作方法同1.3.3。 阴性对照为不加质粒的感受态细胞。

1.3.5 电压对电转化率的影响

按1%接种量将S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液体培养基中，37 ℃培养，收集OD600为0.8的菌体，利用电转缓冲液Ⅱ制备感受态细胞，具体制作方法同1.3.3。设置电压为1.4、1.6、 1.8、2.0、2.2和2.4 kV进行电转化。37 ℃静置培养48～72 h后，比较不同电压对电转化率的影响结果。阴性对照为不加质粒的感受态细胞。

1.3.6 质粒浓度对电转化率的影响

按1%接种量将S.thermophilussp1.1接入含有10 g/L甘氨酸的MRS液体培养基中，37 ℃培养，收集OD600为0.8的菌体，利用电转缓冲液Ⅱ制备感受态细胞，制备电压选取1.8 kV，具体制作方法同1.3.3。设计质粒质量浓度设为0.2～1.6 g/L进行电转化。37 ℃ 静置培养48～72 h后，比较不同电压对电转化率的影响结果。阴性对照为不加质粒的感受态细胞。

2 结果与讨论

2.1 红霉素杀伤曲线

结果如表1所示，初选质量浓度梯度为5 μg/mL，结果显示红霉素质量浓度为5 μg/mL时，S.thermophilus能够生长，红霉素质量浓度为10 μg/mL时，S.thermophilus不能生长，说明S.thermophilus对红霉素比较敏感，降低浓度梯度为2.5 μg/mL，在质量浓度达到7.5 μg/mL时S.thermophilus不能生长，因此，后续实验红霉素抗性平板质量浓度为7.5 μg/mL。

表1 红霉素对S.thermophilus的影响Table 1 Effect of S. thermophilus by erythrocin

2.2 甘氨酸对S. thermophilus转化率的影响

结果显示甘氨酸会影响S.thermophilus的生长(图1-A)，培养基中的Gly添加量不同，对S.thermophilus的生长影响程度不同，Gly添加量与细胞的生长速率呈现负相关，即甘氨酸添加量越高，细胞生长越缓慢，分析培养12 h的S.thermophilus生长结果，Gly添加量为10～40 g/L的培养基中S.thermophilus的生长速率为在正常培养基中的74.6%、42.3%、29.8%和24.1%；当Gly添加量达到50 g/L时，S.thermophilus基本不生长。

选取各组菌株对数生长期(OD600≤0.7)，制作感受态细胞，未添加Gly、Gly添加量为30和40 g/L的实验组，其转化效率为0；Gly添加量为10 g/L的实验组，转化效率最高，结果见图1-B，可能由于Gly在菌体生长过程中取代肽链上的L-丙氨酸和D-丙氨酸，影响由双糖单位(N-乙酞葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸)、短肽链和肽桥组成的肽聚糖的结构[25]，这种替代造成了丙氨酸与尿苷二磷酸胞壁酸的连接，而酶因无法识别底物而受阻，使得合成含Gly的肽聚糖前体物积累,破坏了细胞壁生长过程中肽聚糖合成与酶水解的平衡。因此合成的肽聚糖有缺陷,使得细胞壁变得疏松[26]。但Gly添加量过大会导致菌体死亡，后续实验选择Gly的添加量为10 g/L。

图1 甘氨酸浓度对菌体生长(A)及转化效率(B)的影响Fig.1 Effect on cell growth (A) and conversion efficiency (B) under different glycine content注：图中不同小写字母代表差异显著，P<0.05。下同。

2.3 菌体生长时期对电转化效率的影响

如图2所示，细菌在不同生长时期的转化效率不同，总体呈现先上升后下降的趋势。利用生长初期细胞(OD600<0.8)制作的感受态细胞，转化效率随OD值的增加而上升；当OD600=0.8时，转化效率达到最高，可产生近120个转化子；利用对数生长期后期细胞(OD600>0.8)制作的感受态细胞，转化效率随OD值的增加而下降，由于在OD600=0.8时，细胞处于最旺盛的生长阶段，细胞活力最高，代谢旺盛，细胞壁结构相对松散，电击时易于形成空洞，有效转化菌株量多，随着生长时间的增加，细胞逐渐衰亡而使转化菌株量减少[27]，因此后续实验选择将S.thermophilus培养至OD600=0.8制作感受态细胞。

图2 细菌不同生长时期对转化率的影响Fig.2 Effect of growth phase on transformation efficiency

2.4 电压对电转化效率的影响

结果如图3所示，电压对转化率的影响总体呈现先上升后下降的趋势，转化电压相对较低时(1.4～1.8 kV)，细胞难以极化产生孔洞，DNA不能进入，随着电压的升高[28]，转化效率随之增大，电压达到1.8 kV 时，转化效率最高，如果转化电压继续增大，细胞会因细胞膜损伤过大而死亡，转化效率反而呈下降趋势[29]，因此后续实验选择转化电压为1.8 kV。

图3 不同电压对转化率的影响Fig.3 Effect of voltage on transformation efficiency

2.5 质粒浓度对电转化效率的影响

结果如图4所示，在质粒质量浓度为0.2～1.0 g/L时，电转化效率随着质粒浓度增大而提高，质粒质量浓度达到1.0 g/L时电转化效率最高，随后在质粒质量浓度为1.0～1.6 g/L时，电转化效率随着质粒浓度的增大而降低，质粒质量浓度在1.0 g/L时达到饱和，再增加质粒浓度会阻塞细胞孔洞，从而使转化菌株减少，高玲等在多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化试验中，所得的质粒添加量对转化菌株的影响也呈此趋势[30]。因此后续实验选择质粒质量浓度为1.0 g/L。

图4 不同浓度质粒对转化率的影响Fig.4 Effect of differentcontent of plasmid on transformation efficiency

2.6 电转缓冲液对电转化效率的影响

将S.thermophilus接入含10 g/L Gly的M17培养基中，接种量为1%，37 ℃培养至OD600=0.8，选择不同电转缓冲液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和100 g/L甘油)制作感受态细胞，配制1.0 μg/μL质粒用于转化，用1.8 kV电压进行电转化，研究不同电转缓冲液对电转化效率的影响。

如图5所示，不同电转缓冲液处理的感受态细胞电转化率不同，用电转缓冲液Ⅰ和Ⅱ处理的细胞，转化效果较好，电转缓冲液Ⅱ的处理效果优于电转缓冲液Ⅰ；电转缓冲液Ⅳ处理的感受态细胞，在转化时发生了击穿的现象，可能由于电击介质的电阻过低造成了这种现象；电转缓冲液Ⅲ和100 g/L甘油处理的感受态细胞转化率为0，说明这2种电转缓冲液不能使S.thermophilus形成感受态，后续实验选择电转缓冲液Ⅱ作为电转化缓冲液。

图5 不同缓冲液对转化率的影响Fig.5 Effect of different buffer on transformation efficiency

3 结论

S.thermophilus红霉素的敏感阈值为7.5 μg/mL，甘氨酸添加量、菌体生长时期、转化电压、质粒质量浓度和电转缓冲液均影响S.thermophilus的转化效率，本研究选择甘氨酸质量浓度为10 g/L、菌体生长至OD600=0.8、转化电压为1.8 kV、质粒质量浓度为1.0 g/L、 选择电转缓冲液Ⅱ。本研究为后续构建嗜热链球菌基因工程菌株奠定了一定的基础。