一株链霉菌的鉴定及其产bafilomycin A1的发酵工艺研究

周剑,方志锴,孙菲,江红

(福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福州，350007)

Bafliomycins是一类由放线菌发酵产生的含有16元环骨架的多烯大环内脂类抗生素，化学结构极为特殊，大部分衍生物的侧链结构中都含有1个六元环的半缩醛结构[1]。其结构类似物有bafilomycin A1，A2，B1，B2，C1，C2，D,E,F～J等[2]。其中bafilomycin A1是一种空泡H+-ATP酶(vacuolar-type H+-ATPase,V-ATPase)的特异性抑制剂，能够抑制自噬体和溶酶体结合而抑制自噬[3-4]。V-ATPase广泛分布于真核生物的液泡，反式高尔基体，溶酶体，核内体，分泌颗粒等细胞内膜系统中，根据细胞器官的微小酸性差别，各自发挥独立机能，是一种新的药物靶点[5-7]。

目前已报道的bafliomycins产量都不高，WERNER等[8]从100 L灰色链霉菌的发酵产物中分离得到bafliomycins A1 45 mg、A2 36 mg、C1 120 mg，YU等[9]从菌株YIM56209的9.6 L发酵产物分离得到bafliomycins C1 1.8 mg。CARR等[10]从海洋来源的放线菌分离到bafilomycin F，其生物产量也极低。LEE等[11]报道发酵过程添加80 mmoL缬氨酸可以使bafilomycins产量达到 35 mg/L。国内魏刚等[2]报道从海洋放线菌Y12-26中分离得到bafilomycin A1，且产量极低。潘华奇等[12]报道卡伍尔链霉菌经发酵产生的bafilomycin B1和bafilomycin C1含量分别达23.45 mg/L和6.603 mg/L。杨巍民等[13]报道海洋放线菌Y-0117在40 L发酵液得到bafilomycin D纯品约0117A(14.7 mg)。 由于微生物发酵生产bafliomycins产量的低下，其应用受到极大的限制。目前已有学者对bafliomycins的生物合成途径进行研究[14-17]，但是关于菌种诱变、发酵代谢调控方面研究较少。

本课题组致力于从微生物代谢产物中筛选抗肿瘤化合物。前期从一株链霉菌FIM-B0711发酵液中发现了具有抗肿瘤活性的组分。对FIM-B0711发酵液中的有效成分进一步分离纯化得到化合物BAF0711-A，经波谱方法鉴定，化合物BAF0711-A为大环内脂类抗生素bafilomycin A1[18]。由于原始菌株发酵水平比较低，本文先后利用单因素实验、正交试验设计等对放线菌FIM-B0711的发酵培养条件及发酵工艺进行优化，旨在提高bafilomycin A1的产量，为后续扩大培养提供合适的技术基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

S30K型pH仪,瑞士梅特勒公司；INNOVA-5000型双层摇床，New Brunswick Scientific公司；Agilent 1260 DAD高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.2 实验菌株

菌种链霉菌FIM-B0711，由本研究室筛选保藏。

1.3 培养基

斜面培养基：ISP2；分离平板培养基：ISP2；种子培养基(g/L)：麦芽浸粉20，蛋白胨20，CaCO310(pH为7.2)；发酵培养基(g/L)：麦芽浸粉20，蛋白胨20，CaCO310(pH为7.2)。

1.4 培养方法

斜面28 ℃培养10～12 d待孢子生长成熟以后，刮取新鲜孢子接于种子培养基，置于28 ℃培养，摇床转速为220 r/min，培养48 h左右；按接种量5.0%接种到发酵培养基，后置于28 ℃，摇床转速220 r/min，振荡培养120 h。

1.5 链霉菌FIM-B0711的鉴定

(1)形态学观察：平皿插片法[19]。

(2)培养特征与生理生化特征，采用国际链霉菌计划(ISP)以及参照《链霉菌鉴定手册》中推荐的培养基，于28 ℃培养10～20 d后观察记录菌株培养特征和生理生化特性[20]。

(3)16S rDNA基因序列分析，用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用通用引物(27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,1492R: 5’-CCTTA-CCTTGTTACGACTT-3’)进行16SrDNA扩增(94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃总延伸10 min)。扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收，测序。所测的16S rDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较。采用Mega 4.0 软件菌株进行系统发育分析，利用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.6 分析方法

1.6.1 Bafilomycin A1产量测定

采用Agilent高效液相色谱HPLC-1200系列，色谱柱，Syncronis C18分析柱(4.6 mm×250 mm，填料粒径5 μm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)=85∶15(等度洗脱)，进样量：20 μL，流速：1.0 mL/min，洗脱时间：30 min，检测波长：248 nm，柱温：40 ℃。

样品制备：发酵液加入2倍体积无水乙醇，混匀、振荡20 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液即为测定液。

标准曲线的绘制：准确称取bafilomycin A1标准品12.00 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配成质量浓度为1 200 μg/mL的标准品溶液，采用2倍稀释法精确吸取该标准品溶液，用甲醇稀释成18.75、37.5、75、150、300、600 μg/mL的系列溶液，分别取10 μL注入HPLC仪，以质量浓度(φ，μg/mL)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，线性回归方程为：y= 30 013x+53 907，R2=1。根据公式(1)计算样品产量。

(1)

1.6.2 菌丝浓度PMV的测定

取发酵液10 mL于10 mL刻度试管中，离心沉淀(5 000 r/min，15 min)，记录沉淀物体积，mL。根据公式(2)计算菌丝浓度。

(2)

1.7 培养基与培养条件优化

1.7.1 单因素试验

采用单因素试验考察发酵培养基的组成如碳源、氮源、无机盐(微量元素)、培养条件等对发酵产量的影响。

1.7.2 正交实验设计

采用单因素实验中确认对发酵产量影响较大的碳源、氮源成分做为正交试验的因素进行考察。水平的设定主要从常用量出发，并在尽可能大的范围内波动。以目标产物的产量为指标，按表1进行实验，每组平行实验3组，结果取平均值。实验数据采用正交设计助手Ⅱ V3.1专业版进行分析。

表1 正交实验设计因素水平表L9(34) 单位：g/L

1.7.3 摇瓶发酵过程的影响因素考察

采用单因素实验法考察发酵培养条件对产量的影响，主要从以下方面考察：接种量(1.0%、2.5%、5.0%、 7.5%、10.0%)、发酵周期(24、36、48、60、72、84、96、108、120 h)、摇瓶装量(60、80、100、120 mL)、 发酵温度(26、28、30、32、34 ℃)、摇床转速(120、140、160、180、200、220、240 r/min)、培养基原始pH值(5.5、 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)等进行。实验数据采用Excel软件进行作图分析，取标准误差(SD)作为误差线。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

2.1.1 形态学观察

链霉菌FIM-B0711革兰氏染色为阳性，在高氏合成一号琼脂和ISP2等培养基上生长7 d后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂。气生菌丝生长良好，多分枝，孢子丝直或柔曲。

2.1.2 培养特征

采用ISPl、ISP2、ISP3、ISP4等7种培养基，30 ℃培养14 d后，观察菌丝体的颜色及色素情况。结果见表2。

表2 FIM-B0711培养特征Table 2 Cultural characteristics of strain FIM-B0711

注： “+ + +”表示好; “+ +”表示中等; “+”表示差。

2.1.3 生理生化特征

生理生化性质采用链霉菌分类中的标准方法。菌株FIM-B0711的生理生化反应为：明胶液化，深褐色素。牛奶凝固并胨化，淀粉水解好。纤维素上生长不良，硝酸盐还原，产生类黑色素和H2S。利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-甘露醇、肌醇，不利用L-阿拉伯糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖。

2.1.4 16S rDNA基因序列分析

根据菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rDNA序列综合分析(图1)，将菌株FIM-B0711鉴定为灰褐色链霉菌(Streptomycesgriseobrunneus)。

图1 FIM-B0711基于16S rDNA构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree derived from 16S rRNA sequence of strain FIM-B0711

目前已有文献报道产生巴弗洛霉素类化合物的微生物菌株主要有：卡伍尔氏链霉菌(Streptomycescavourensis)[12]、黄三素链霉菌(Streptomycesflavotricini)[13]、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)[11]、海洋放线菌(Streptomycessp.)[10]、海洋链霉菌(Streptomyceslohii)[14]以及白色链霉菌(Streptomycesalbolongus)[21]等。经对比菌株FIM-B0711与以上菌株都不同，是一株新的巴弗洛霉素产生菌。

2.2 摇瓶发酵培养基的考察

2.2.1 单因素考察碳氮源对bafilomycin A1发酵产量的影响

采用单一因素试验考察碳氮源对发酵产量的影响，以WERNER配方为初始培养基[6]，培养基按照20 g/L 碳源，20 g/L氮源配比。其中考察了实验室常用的12种碳源：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、甘油、可溶性淀粉、糊精、麦芽糊精、马铃薯糊精、马铃薯淀粉，以及实验室常用的12种有机氮源：玉米蛋白、玉米浆、黄豆粉、黄豆饼粉(热轧)、黄豆饼粉(冷轧)、大豆蛋白胨、土豆蛋白、蚕蛹粉、酵母粉、鱼胨、牛肉膏、棉籽粉，均以初始培养基作为对照。

由图2碳源试验结果可见，使用可溶性淀粉作为碳源产量提高较明显，可以选用可溶性淀粉作为下一步优化实验的碳源。

图2 不同碳源的发酵水平的比较Fig.2 Comparison of different carbon sources used for Bafilomycin A1 production

由图3氮源试验结果可见，以酵母粉、玉米浆为氮源时发酵产量较高，而对照培养基为蛋白胨，考虑到菌株对复合氮源的需求，故选用酵母粉、玉米浆和蛋白胨作为候选氮源进行下一步试验。

图3 不同氮源的发酵水平的比较Fig.3 Comparison of different nitrogen sources used for bafilomycin A1 production

2.2.2 无机盐对bafilomycin A1发酵产量的影响

主要考察选择实验室中常用的无机盐和金属离子对发酵产物的影响，一价金属离子的添加量为2 g/L(主要有(NH4)2SO4、NaCl、K2SO4、KH2PO4、K2HPO4、NaNO3)，二价金属离子的无机盐添加0.5 g/L(主要有MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4、CaCl2)；对照培养基为含2 g/L CaCO3。

结果如图4所示，添加无机盐和金属离子并不能提高产量，培养基中只需添加2 g/L的CaCO3即可，这样也简便了培养基配方。

图4 无机盐对bafilomycin A1发酵产量的影响Fig.4 Effect of inorganic salt on bafilomycin A1 production

2.2.3 正交试验设计考察碳氮源组合对发酵产量的影响

以单因素优化筛选出的比较好的碳源(可溶性淀粉)、氮源(酵母粉、玉米浆和蛋白胨)做4因素3水平正交实验(表3)。其他发酵因素无机盐、发酵条件等都保持一致，重复3次。以发酵终点时bafilomycin A1的发酵产量为指标，来确定最优的碳氮源配方比例。

表3 正交实验设计方案及结果Table 3 Orthogonal experiment design and results

从表3极差R值可以看出，影响bafilomycin A1发酵产量的4个因素的主次顺序为可溶性淀粉>玉米浆>酵母粉>蛋白胨，可溶性淀粉含量因素对其合成影响最为显著，是最关键的因子，其次是玉米浆。综上，发酵培养基碳氮源的最佳培养基配方为(g/L)： 可溶性淀粉40、蛋白胨30、酵母粉20、玉米浆15、CaCO32。

2.3 摇瓶发酵过程环境因素的影响

发酵培养过程中环境因素对次级代谢产物的生成影响较大。这些因素包括：接种量、发酵时间、摇瓶装液量、发酵温度、摇床转速、培养基初始pH值(图5)。

可以得出，最适的培养条件为：接种量5.0%，发酵周期96 h，500 mL摇瓶装液量100 mL，培养温度28 ℃， 摇床转速220 r/min，培养基初始pH值为7.0。

图5 不同发酵条件对bafilomycin A1的发酵产量的影响Fig.5 Comparison of different fermentation conditions on bafilomycin A1 production

2.4 优化后发酵工艺的验证

在综合最优条件下，对链霉菌FIM-B0711在摇瓶水平进行5批发酵验证试验，结果显示在最佳培养基配方和优化培养条件下，HPLC检测图谱如图6、图7所示，发酵液相对产量分别为447.9%、453.3%、432.1%、425.8%和462.1%，平均相对产量444.24%，发酵水平提高了344%以上。

图6 发酵工艺优化前的bafilomycin A1 HPLC图谱Fig.6 HPLC profiles of bafilomycin A1 produced by strain FIM-B0711 cultivated under original conditions mAU

图7 发酵工艺优化后的bafilomycin A1 HPLC图谱Fig.7 HPLC profiles of bafilomycin A1 produced by strain FIM-B0711 cultivated under optimized conditions

3 结论

本论文对实验室筛选获得的抗肿瘤海洋链霉菌FIM-B0711进行菌种鉴定，经对比FIM-B0711与目前已有文献报道巴弗洛霉素类化合物的产生菌(Streptomycescavourensis、Streptomycesflavotricini、Streptomycesgriseus、Streptomyceslohii、Streptomycesalbolongus等)都不同，是一株新来源的巴弗洛霉素产生菌，经鉴定为灰褐色链霉菌(Streptomycesgriseobrunneus)。并在摇瓶水平进行发酵工艺初步研究。首先针对其发酵培养基进行了优化，在利用单因素试验筛选合适的碳氮源种类的基础上，应用正交实验的设计方法，进一步明确了发酵培养基有关成分，确定了各因素的最优势的配方组合。其次从发酵周期、装液量、转速、接种量、消泡剂等方面，对摇瓶的发酵工艺进行了初步优化。

发酵较适配方(g/L)：可溶性淀粉40、蛋白胨30、酵母粉20、玉米浆15、CaCO32。最适的培养条件为：接种量5.0%，发酵周期96 h，500 mL摇瓶装液量100 mL，培养温度28 ℃，摇床转速220 r/min，培养基初始pH值为7.0。对比优化后的工艺较原始工艺发酵液中bafilomycin A1的产量提高了约344%，为规模化发酵奠定了基础。