新型醋酸纤维素薄膜电泳缓冲液的研究

吴桂梅 汪瑶 赵小峰 金磊 贺玲

（徐州医科大学，国家基础医学实验教学示范中心，江苏徐州 221004）

电泳是生物化学研究中常用的一种实验手段，其中醋酸纤维素薄膜电泳是常用的一种电泳技术。醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术，该电泳技术具有电渗小、分离速度快、样品用量小、分辨率高、分离清晰等优点。此外，该电泳的操作方法比琼脂糖电泳、淀粉胶电泳和聚丙烯酸胺凝胶电泳简便，而且染色后的薄膜便于保存和定量分析[1-3]。因此，醋酸纤维素薄膜电泳成为生物化学常用的实验技术之一，该电泳可用于血清蛋白电泳、脂蛋白电泳、同功酶电泳、甲种胎儿球蛋白电泳、血红蛋白电泳以及免疫电泳等[1]。

醋酸纤维素薄膜电泳实验最常用的缓冲液是巴比妥缓冲液，巴比妥缓冲液缓冲能力强、稳定性好，以该缓冲液为电泳介质的样品分离效果好，但该缓冲液中用到的巴比妥和巴比妥钠作为麻醉镇静药物，安全性存在隐患，在试剂采购方面也存在限制，因此研究适用于醋酸纤维素薄膜电泳的新型缓冲液具有重要的意义。本研究以人血清为样品进行醋酸纤维素电泳来检验不同电泳缓冲液的效果。

1.材料与方法

1.1 实验材料

醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）；人血清；巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）[1]：巴比妥1.66 g，巴比妥钠12.76g，加水溶解定容至1L；硼酸缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）[4]：硼酸5.60g，四硼酸钠5.61g，氯化钠1.32g，加水溶解定容至1L；Tris-硼酸缓冲液：Tris 7.5g,硼酸5.60g，四硼酸钠5.61g，氯化钠1.32g，加水溶解定容至1L；染色液[1]：氨基黑10В 0.5g，溶于甲醇50ml，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。漂洗液[1]：乙醇45ml，冰醋酸加ml，蒸馏水50ml。

1.2 实验方法

1.2.1 准备

电泳槽内放适量的缓冲液，在电泳槽内侧的支持板上用纱布搭桥，分别使其一端搭到支持板上，另一端浸入缓冲液中。

取缓冲液浸透后的醋酸纤维素薄膜（2cm×8 cm），用滤纸轻轻吸去膜上多余的缓冲液，辨别无光泽面，在无光泽面距一端约2.0cm处，用铅笔画一条线（与此端平行），作为点样线。

1.2.2 点样

把膜的无光泽面向上，将样品均匀地涂于盖玻片的一端，点样到膜的点样线上（点样时可将盖玻片45度角倾斜，这样点样线比较细，样品的分离效果更好），使样品浸入膜内。

1.2.3 电泳

用镊子夹住薄膜的一端，把膜放进电泳槽，膜的点样面向下，点样端置于阴极侧但不能接触纱布，把膜的两端紧贴到内侧支持板上搭桥的纱布上，把膜摆平拉直，盖好电泳槽盖。接通电泳仪电源，稳压110V，通电45min。

1.2.4 染色

电泳结束后关闭电源立即取出薄膜，放入染色液中浸染5min，然后取出薄膜控净多余染色液，放入漂洗液中依次漂洗3次，至无蛋白处无色为止，取出薄膜用滤纸吸干。

2.实验结果

2.1 以巴比妥缓冲液作为电泳介质的醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清蛋白结果

以常用的巴比妥缓冲液作为电泳介质得到的醋酸纤维素薄膜电泳图谱见图1，能够清晰分离出5条区带。因所用缓冲液的pH值大于血清各种蛋白质的等电点（见表1），各种蛋白质皆带负电，通直流电时，皆向正极方向泳动。血清各蛋白质的分子大小及带电量不同（见表1），因此各蛋白的泳动速度不同，从而被分离，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白，见图1标记。

图1 以巴比妥缓冲液为电泳介质的血清蛋白图谱

表1 血清蛋白质的等电点、分子量、正常血清中各蛋白的含量[1]

2.2 以硼酸缓冲液作为电泳介质的醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清蛋白结果

以硼酸缓冲液作为电泳介质得到的电泳图谱见图2，图中可见分离出4条区带，对比巴比妥缓冲液得到的电泳图谱推测其为清蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。

图2 以硼酸缓冲液为电泳介质的血清蛋白图谱

2.3 以Tris-硼酸缓冲液作为电泳介质的醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清蛋白结果

以硼酸缓冲液作为电泳介质进行的醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清蛋白并未取得预期的实验效果，在本文的硼酸缓冲液配方的基础上我们加入了Tris，并且经过大量的实验确定了合适的用量以及电泳条件。以我们配制的Tris-硼酸缓冲液作为电泳介质得到的电泳图谱见图3，分离出5条区带，分别为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白，条带清晰。

图3 以Tris-硼酸缓冲液为电泳介质的血清蛋白图谱

3.实验讨论

醋酸纤维素薄膜电泳作为一种重要的生化分析技术，在临床、科研以及高校实验教学中有着非常重要的作用，但是目前常用的电泳介质巴比妥缓冲液作为麻毒类药品，除了价格高昂之外，还存在潜在的危险，并且采购受到管控，所以能够替代巴比妥缓冲液的新型缓冲液的研制刻不容缓。

硼酸缓冲液也具有较好的缓冲能力，其中用到的硼酸、四硼酸钠和氯化钠都是成本低、易采购的试剂。因此硼酸缓冲液是近年来研究比较多的在醋酸纤维素薄膜电泳中用来替代巴比妥缓冲液的一种缓冲液[5-8]。之前的报道显示硼酸缓冲液可以取得良好的效果，能够替代巴比妥缓冲液用于醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白[4,7]，但是我们的结果显示以巴比妥缓冲液作为电泳介质将人血清分离出5条蛋白区带，而以硼酸缓冲液作为电泳介质，只是分离出4条蛋白区带，这表明硼酸缓冲液并不能取代巴比妥缓冲液成为优质的醋酸纤维素薄膜电泳的电泳介质。Tris易溶于水，对很多酶呈惰性反应，在pH7.5～9.0有较强的缓冲能力，可用于稳定反应体系的PH值，常用于配制各种缓冲液，我们在该缓冲系统中加入Tris配制Tris-硼酸缓冲液，经过一系列的实验，最终确定了该缓冲液Tris的用量（见本文缓冲液配方）从我们的实验结果可以看到经过改良的Tris-硼酸缓冲系统成功的将人血清分离出5条蛋白区带，具有与巴比妥缓冲液相似的分离效果。

我们研制的Tris-硼酸缓冲液不仅在醋酸纤维素薄膜电泳中对样品有很好的分离效果而且易获得，因此可以替代巴比妥缓冲液用于醋酸纤维素薄膜电泳。我们的研究成果具有非常重要的意义，现在我们已经将其应用于学生的实验课中，取得了良好的实验教学效果。