优化三个因素改善血浆蛋白醋酸纤维薄膜电泳效果*

姚 蕾，李雨勤，吴永亮，黎威巍，金科华

(湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100)

血浆蛋白电泳图谱的类型可为疾病的诊断提供依据，理想的电泳条带是提供诊断依据的前提。电泳条带不清晰，条带数量少均导致定量困难，从而无法提供诊断依据。为此，优化影响电泳的因素，提高电泳分离效果十分必要。血浆蛋白醋酸纤维薄膜电泳(简称电泳)实验常用盖玻片或X光胶片点样，用pH8.6、离子强度0.06的巴比妥-巴比妥钠缓冲液电泳[1]。这些点样材料和缓冲液有不少弊端：首先，血浆在盖玻片和X光胶片上难以分布均匀，以致无法形成整齐的点样线，造成电泳条带数量少、条带不清晰、条带畸形；其次，巴比妥钠有毒[2]，价格昂贵，不易采购；此外，巴比妥缓冲液电泳分离的条带间距小，很难得到6条带，不便于后续各类蛋白的定量。为此，本研究拟比较点样材料、磷酸缓冲液缓浓度及点样量对电泳效果的影响，确定最佳点样材料、最适缓冲液浓度和最适点样量，从而建立理想的电泳体系，为后续的条带定量和临床疾病诊断奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DYY-6C电泳仪电源、DYCP-38C电泳槽购自北京六一仪器厂；8cm×2cm乙酸纤维素薄膜(简称薄膜)为路桥四甲生化塑料厂产品；30cm×30cm双圈牌滤纸为杭州沃华滤纸有限公司产品；No.0015厚层订书为得力集团有限公司产品。

分析纯Na2HPO4、KH2PO4分别为天津市致远化学试剂有限公司、广东西陇化工厂产品；氨基黑、无水乙醇为国药化学试剂有限公司产品；无水甲醇为广东省精细化学品工程技术研究开发中心产品；冰乙酸为天津市富宇精细化工有限公司产品。据刘汉才的方法[3]配制pH8.67 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(简称缓冲液)；按孙聪的方法[4]配制染色液、漂洗液。

抽取本文作者吴永亮静脉血15mL，分装于含枸橼酸钠的抗凝管，4℃4000r/min离心10min，取上层血浆小份分装，-20℃保存备用。

1.2 薄膜的准备与搭桥

将薄膜糙面朝下逐条放入盛有缓冲液的培养皿中，用镊子轻压薄膜的表面，使其浸泡在缓冲液中30min以上。取出浸泡的薄膜，置于缓冲液润湿的滤纸上[5]，吸取多余的水分[6]。向电解槽的正负极加等高的缓冲液[7]。用双层滤纸搭桥，滤纸与槽紧贴，无气泡，表面平整。

1.3 点样、平衡及电泳

将浸泡好的薄膜置于润湿的滤纸上，用三种材料点样。①滤纸条点样。将滤纸裁剪成1cm×1mm的小条，用缓冲液润湿，贴于薄膜点样处(距一端约2cm，下同)，用移液器取血浆均匀涂布于滤纸条上。点样完毕，用纸巾吸取薄膜下滤纸的水分，使血浆加速渗入薄膜内。②火车票点样。将磁质火车票横向裁成宽1cm的条，用移液器取血浆均匀涂布于火车票1cm的横截面，将火车票血浆印于点样处。③订书钉点样。用橡皮擦固定订书钉的两端，将血浆均匀涂布于订书钉上，再将血浆印于点样处。薄膜点样端置于电泳槽负极，粗面向下，平整垂直地贴于滤纸桥上，平衡5～15min[8]，110V电泳40min。

1.4 染色与漂洗

电泳后的薄膜放入染色液中染色10min，取出薄膜于漂洗液中连续漂洗数次，直至条带清晰，背景干净。

1.5 探索最佳点样材料

取2μL血浆，按1.3分别用滤纸条、火车票和订书钉点样，在0.25×的缓冲液中电泳，比较不同点样材料分离的条带数量和清晰度，确定最佳点样材料。

1.6 探索最佳缓冲液浓度

将1×缓冲液依次稀释2倍(0.5×)、3倍(0.33×)、4倍(0.25×)、5倍(0.2×)，用最佳点样材料点样2μL血浆，分别在不同稀释倍数的缓冲液中电泳，比较分离的条带数量和清晰度，确定最佳缓冲液浓度。

1.7 探索最佳点样量

分别取0.5、1、2、3、4μL血浆，用最佳点样材料点样，在最佳浓度的缓冲液中电泳，比较分离的条带数量和清晰度，获得最佳点样量。

2 结 果

2.1 滤纸条点样电泳效果最好

滤纸条、火车票和订书钉点2μL血浆的薄膜，用0.25×缓冲液电泳，结果见图1(封二)，由图可知膜a、b均有6条带；但膜b中的条带拖尾明显；膜c只见颜色较浅的5条带。由此认为滤纸条点样效果最好。

2.2 0.5×缓冲液电泳效果最好

用滤纸条点2μL血浆的薄膜，在1×、0.5×、0.33×、0.25×、0.2×缓冲液中电泳结果见图2(封二)。由图可知，膜b、c、d上均有6条带；膜a只见5条带，且间距短，条带重叠；膜e只见4条带，且条带很淡。随着缓冲液浓度降低，条带间距增大，条带拖尾愈明显。0.5×缓冲液的结果条带间距适中、清晰度最佳。

2.3 2μL血浆电泳效果最好

用滤纸条分别点0.5、1、2、3、4μL血浆，行0.5×缓冲液电泳，结果见图3(封二)。由图可知，膜b、c、d、e均有6条带；而膜a只见5条带，且条带很淡；随点样量增多，条带颜色逐渐加深，拖尾现象愈发明显。点2μL血浆的薄膜电泳条带颜色及间距适中，清晰度最佳。

3 讨 论

文献报道巴比妥缓冲液在离子强度为0.06～0.09时血清电泳效果较好[6]，而本研究发现稀释两倍的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液电泳效果最好，其离子强度为0.098，超过上述最适离子强度范围的上限。为此，我们推测电泳缓冲液最适离子强度可能因缓冲液种类不同而异。此外，本研究发现缓冲液最适离子强度由电泳血浆所得，与文献电泳血清有所不同，最适缓冲液离子强度是否因电泳材料不同而异需要进一步研究。

冀华等[9]发现订书钉点样的血清电泳后各蛋白质条带无明显拖尾和扩散现象，而本文发现订书钉点样的血浆电泳后仅有5条带，且条带很淡。订书钉和磁质火车票吸水性差，单次承载的最大血浆量分别为0.5和0.8μL，2μL血浆须多次点样才能完成，多次点样易导致点样点偏移，从而导致电泳效果不佳。

本研究有三大创新：一是用滤纸条点样；二是磷酸缓冲液替代有毒的巴比妥缓冲液；三是确定最佳缓冲液浓度。用滤纸条点样可固定点样点，控制点样量，获得均匀、整齐的点样线，电泳条带更清晰；配制磷酸缓冲液所需试剂廉价、无毒，易于购买；稀释缓冲液既能改善电泳效果，又能减少试剂用量、降低实验成本。

综上所述，本研究优化了血浆醋酸纤维薄膜电泳的三个因素：最佳点样材料为滤纸条，最佳缓冲液浓度为0.5×缓冲液，最佳点样量为2μL。实验建立了理想的电泳体系，为基于血浆蛋白电泳条带定量的疾病诊断提供了可靠的技术保障。