3种非接触式点样针性能对比

贾文刚

（上海交通大学生命科学学院，上海数康生物科技有限公司）

引言

随着科学的发展进步,与生物相关的技术也在飞速发展，其中生物芯片技术就是20世纪90年代发展起来的，是影响深远的科技进展之一。

生物芯片技术是将生物学、化学、物理学、光学、微电子学和计算机科学高度结合形成的一项交叉技术。生物芯片技术可以可以用于基因水平的表达检测、基因的诊断、药物的筛选、测序和疾病的诊断等方面[1]。生物芯片是采用光导原位合成或者微量点样等方法，将核酸片段、多肽分子、蛋白等生物样品按照一定顺序固定于基片(玻片、硅片、PDMS、硝酸纤维素膜等)上，形成要求的阵列，然后与待测的生物样品和标记的已知生物样品进行杂交反应，再通过特定的扫描仪如激光共聚焦或者电荷偶联摄像机(CCD)对杂交后的信号进行检测，然后借助相应的软件对杂交后的数据进行快速高效的分析，从而了解待测样品中的生物信息。

生物芯片制作由于考虑到制作成本和技术难度等因素，在制作过程中大都采用微量点样的方法制作生物芯片。微量点样技术是整个微阵列制作仪中的关键技术，微量点样技术是采用接触式或者非接触式将生物样品固定于基质表面，非接触式点样技术由微量液压系统和精确控制的微量点样针协同工作，将样品从点样针尖口直接喷到基质表面，而不用直接接触基质表面。微阵列生物芯片制作仪上搭载的点样技术采用的点样针对生物芯片制作非常关键，本文将对微阵列生物芯片制作仪采用非接触式点样技术使用的3种不同类型的点样针，在点样针的原理、应用和3种针的差异方面做初步研究。

1 材料

CEA(癌胚抗原)-1Ab和CEA-2Ab(CanAg公司)，AFP(甲胎蛋白)-1Ab和AFP-2Ab(CanAg公司)；POD(过氧化物辣根酶)和BSA(小牛血清白蛋白)购自(Roche 公司)；硝酸纤维素膜(WhatMan 公司)；发光液#37075A/B(Thermo Fisher公司)；Nano-Plotter-2000型微阵列生物芯片制作仪(德国GeSim公司)；GT5000型微阵列制作仪(美国BioDot 公司)；CCD检测液(上海铭源数康生物芯片有限公司)。

2 方法

2.1 同一块芯片上采用不同点样针点样

将CEA一抗浓度用磷酸盐缓冲液稀释到0.6mg/ml，裁1块7×8cm的硝酸纤维素膜分别在微阵列芯片制作仪上用Pico tip、Nano tip和Biojet Plus点样针点样，除BiojetPlus针未点10.0nl外，其余都分别点10.0nl和20.0nl，每点点2个复点。

点好的芯片在膜上固定2hr，然后封装到相应的模具内再用2.5%BSA溶液封闭1hr，将液体甩干，在恒温恒湿箱内20℃、RH 30%干燥过夜备用。

在芯片上加配制好的抗原溶液跟膜上固定的抗体反应1hr，反应结束后用tris-盐酸缓冲液冲洗并甩干，加标记了辣根酶的二抗进行反应1hr，再用洗液冲洗拍干，将配制好的发光液加到芯片每个格子内，然后放入CCD扫描仪内扫描拍照，借助相应的软件对扫描结果进行处理分析。

2.2 同一点样针点不同体积的样品

将AFP一抗浓度用磷酸盐缓冲液稀释到0.2mg/ml。3种针分别在各自的机器上点不同体积的样品点。Pico tip 分别点5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl；Nano-tip 分别点5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl；Biojet tip分别点20.0nl、40.0nl、80.0nl、160.0nl,点好芯片采用2.1相同的方法封装、封闭和干燥过程，反应方式也采用2.1同样的方法进行。

2.3 两种点样针采用不同浓度样品和不同体积点样

AFP一抗用磷酸盐缓冲液稀释到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml。2种针分别在各自机器上点不同体积的样品点，Pico tip每点体积设定为5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl；Nano tip每点设定体积为5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nl和80.0nl，每个点点4个复点。制备好的芯片采用2.1相同的方法封装、封闭和干燥，反应方式采用与2.1同样的方法进行。

3 . 非接触点样原理

3.1 注射泵式非接触式点样原理

注射泵式喷点点样技术是借助注射泵的原理，先将样品从点样头吸进管道内或者在整个系统液罐内充满液体样品，喷点时靠注射泵推，同时微小电磁阀打开，将设定的点样体积在瞬间从喷头喷出，喷到芯片基质上形成所需要的阵列。

此种点样技术采用的是陶瓷材料制作的点样针，点样针口径在100-190.0微米（um）,该点样针直接插在微电磁阀下面的细小塑料管上，点样时生物样品直接从该点样针尖口喷出。

3.2 压电式非接触式点样原理

在压电点样针上有一块压电材料，该压电材料与电流接通，在点样过程中给压电材料固定频率的脉冲电压则压电材料变形，从而将腔体内的样品瞬间从针尖挤压出去，形成微小的生物样品点。

压电式点样原理是将生物样品通过点样头吸到管体内，此时注射泵侧通路关闭，而系统液和点样头管子整个贯通，在点样过程中注射泵不动，而是靠点样头处的压电材料变形将微小的样品点从喷头喷出，喷到芯片基质上形成一定阵列。

图2 压电式点样原理[3]

3.3 三种点样针结构对比

压电式点样针腔体背面有一小块压电材料，具体见图，Nano tip和Pico tip的结构和针的孔径有所不同：Nano tip只有一个微小腔体，而Pico tip有2个腔体；Nano tip点样针的孔径为70-75微米，Pico tip孔径为35-40微米。

喷点点样针Biojet tip同微小电磁阀连接，具体外观见图，Biojet tip为中空的锥形结构，点样针的孔径为100-110微米。

4 数据及分析

4.1 三种点样针都采用相同的一抗点样，点样体积在10.0nl和20.0nl时，Pico tip点样针点出的样品发光强度要比Nano tip的发光强度(URL)要高，分别高出16.4%和24.0%,而在点20.0nl条件下，Pico tip和Nano tip点样出的样品发光强度(URL)比Biojet tip分别高出45.0%和16.0%。见图表1

表1 不同点样针信号变化

4.2 不同点样针随点样体积的不同信号和CV的变化

表2 信号随点样体积的变化[不同点样针]

表3 CV随点样体积的变化[不同点样针]

4.3 不同点样针、不同点样体积和不同点样浓度在发光强度和CV上的变化情况

同一种针在相同的点样体积下样品浓度越高，发光强度也会随之升高，这种情况在Pico tip点样针上体现特别明显，但是当点样体积在40.0nl和80.0nl时不同样品浓度的发光强度差异开始缩小。

同一种点样针点样体积越小，CV越大，随着点样体积的增加，CV会逐渐减小。另外发现点样浓度太低可能会影响到CV，点样浓度高对CV的影响相对较小。

表4 点样体积随点样浓度的变化[Pico Tip]

表5 CV随不同点样浓度和不同点样体积的变化[Pico Tip]

?

?

4.4 图像外观

对点出的样品点在显微镜下拍摄，生化反应后对图片进行了整理，具体外观见下图：

5 讨论

从不同点样针点出的点子形态观察，同样体积的点样量使用不同点样针点出的点子直径

有差异，Bio jet tip点同样体积的生物样品点子直径明显比压电的两种点样针点的点子直径要大，Nnao tip点同样体积的点子直径比Pico tip点出的点子直径要小。

本文在硝酸纤维素膜上对3种点样针进行了测试对比。两种压电式点样针点同样体积样品，反应后的发光强度比Bio jet tip要高，根据点样体积不同高出的程度会有变化；点同样体积的样品Pico tip点出的点子反应后发光强度比Nano tip要高，不同点样体积高出的程度会有不同。从均一性考察发现同一种针点样体积越大发光强度的CV越小，通过比较点同样体积的样品Bio jet tip的CV最大，Nano tip的CV最小，Pico tip的CV次之。通过对生物样品点样浓度、点样体积和不同针的状态进行测试，认为在太低的浓度点样可能会影响信号和CV。本次是在硝酸纤维素膜进行侧测试对比实验，在其它基质如醛基化玻片或琼脂糖玻片或PDMS需要对3种点样针重新进行测试对比。

在实际使用中如何选择正确的tip对制作蛋白芯片非常重要。如果做高密度的基因芯片或者需要点极其微小量的样品时，需要选择Nano tip或者Pico tip作为制作芯片的关键部件；如做高密度的蛋白芯片，可以选择Nano tip；对于做非高通量的蛋白芯片或者免疫斑点的定性检测芯片，可以选择Bio jet tip。

Biojet tip是由陶瓷材料制作，一般使用寿命较长，只要没有断裂基本都可以使用，但是对于压电的Nano tip 和Pico tip由于点样针的孔口径在35-75um，因此在使用中要特别注意针的清洗，注意样品中的微小杂质甚至空气的尘埃。

综上所述，生物芯片制作过程中，采用非接触式点样原理点样，了解非接触式点样技术中用的关键部件点样针很重要，点样针选择对制作相应的生物芯片产品非常重要。

[1]马立人，蒋中华.生物芯片[M].北京：化工出版社，2000

[2]BIODOT INC.[EB/OL].HTTP://www.biodot.com

[3]Gesim company [EB/OL].HTTP://www.gesim.de