UPLC-ESI-MS-MS同时检测水产品中的激素残留

Ying Jiang XU, Xiu Hui TIAN, Xiu Zhen ZHANG, Xiang Hong GONG,Shi Juan ZHANG, Hui Hui LIU, Li Min ZHANG

激素，诸如雄激素(AS)、雌激素(ES)和孕激素(PS)等，在生命体中扮演了非常重要的角色。AS是主要的男性类固醇激素，是决定在胚胎发育过程和青春期性成熟过程当中男性特征显现的首要决定因素，通常用于恢复肌肉形状和力量的治疗中[1]。众所周知，雌激素直接影响大脑中控制情绪和认知的区域[2]。目前，很多广泛使用的避孕药物当中都含有乙炔基雌二醇，其作为一种活性成分与PS相结合。雌激素与孕激素的结合也通常被用于治疗更年期综合征[3]。

滥用药物会对水产品产生非常不利的影响。激素可以促进动物的性别差异，减短动物的生长周期[4－6]。双酚A可以导致剑尾鱼的细胞凋亡，雄性鳉鱼在产卵期前接触水中的双酚A会增加鱼卵的死亡率[7]。二乙烯基雌酚会对海中鲤鱼类的甲状腺系统如垂体、甲状腺组织和脱碘酶产生一系列的破坏作用[8]。几种已知的激素经常被添加到水产品中来提高养殖效率。激素比较稳定而且不易降解，当通过食物链进入人体后，仍具有很强的生物活性和潜在的致癌性，容易引发中性肥胖、免疫缺陷和骨质疏松等疾病[9,10]。

目前有很多方法可进行动物组织中激素的监控和检测。通常这些方法可以分为两类。1)免疫学方法：基于抗原-抗体的特异性相互作用产生的高选择性，但因天然抗体的稳定性较差，所以该方法应用范围较窄，并且很容易出现假阳性的结果[11,12]。2)色谱方法：最常用的激素检测方法包括HPLC[13,14]，LCMS[15,16]，GC-MS[17,18]等。然而这些方法也有一些相应的缺点。HPLC通常只能采用常规方法，而不能进行特殊的检测。GC-MS需要在色谱分离之前进行衍生化，因为多数组分本身具有热不稳定性、非挥发性或者极性等特征。然而，衍生化过程使得样品处理步骤变得复杂而费时，并且会造成目标类固醇的损失或者降解。

UltraPerformance LC®(UPLC®)(Waters Corp.,Milford, MA)与电喷雾串联质谱联用(UPLC-ESI-MSMS)具有高的分离效率和鉴定准确率，目前已经成为分析测定激素的首选方法[19－24]。本文作者发展了一种同时测定水产品中24种激素的方法，并对样品处理方法和仪器分析条件进行系统性优化后得到了较为满意的结果。

1 实验部分

1.1 材料

去乙酰环丙氯地孕酮醋酸盐和乙羟基二降孕甾烯炔酮购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)。4-n-辛基苯酚购自Supelco (Bellefonte, PA)。双酚A、4-壬基苯酚、二乙烯基雌酚、雌激素酮、17α-乙炔基雌二醇，17β-雌二醇、雌三醇、甲地孕酮醋酸盐、三氨乙基胺、炔诺酮醋酸盐、脱水羟基孕酮、孕酮、赤霉烯酮、己雌酚、氯化孕酮醋酸盐、睾丸激素、勃地酮、19-去甲睾酮、甲睾酮、去氢孕酮和双烯雌酚均购自Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany)。甲醇、甲基叔丁基醚和乙腈均为色谱纯级别，购自Tedia(Fairfield, OH)。水为去离子超纯水。实验中用到的其他试剂均为分析纯。

1.2 储存溶液和标准溶液的准备

所有组分的储存溶液浓度均用色谱纯的甲醇配制为100 μ g/mL并保存在－20 ℃。标准溶液是将所有组分混合并用甲醇稀释。在分析过程中使用的溶液均为所有组分的储存溶液在分析当日进行混合稀释而成。24个组分(100 μg/mL) 的总离子流色谱图见图1。

图1 24种激素的总离子流色谱图。每种激素对应的保留时间为：雌三醇(2.63 min)，三氨乙基胺(3.98 min)，勃地酮(4.14 min)，诺龙(4.29 min)，双酚A (4.15 min)，赤霉烯酮(4.36 min)，17β-雌二醇(4.38 min)，睾丸激素(4.58 min)，17α-乙炔基雌二醇(4.74 min)，己雌酚(4.88 min)，甲睾酮(4.91 min)，脱水羟基孕酮(4.98 min)，二乙烯基雌酚(5.13 min)，双烯雌酚(5.24 min)，雌激素酮(5.25 min)，左旋-18-甲基炔诺孕酮(5.36 min)，去氢孕酮(5.73 min)，去乙酰环丙氯地孕酮醋酸盐(6.09 min)，甲地孕酮醋酸盐(6.15 min)，孕酮(6.22 min)，炔诺酮醋酸盐(6.23 min)，氯化孕酮醋酸盐(6.28 min)，4-n-辛基苯酚(7.93 min)，4-壬基苯酚(8.08 min)。

1.3 样品的预处理和纯化

样品(5 g)在20 mL的乙酸乙酯中匀浆30 s，同时加入3 mL 10%的碳酸钠溶液，然后在室温下超声10 min。匀浆在7000 r/min下离心10 min。将上层清液在40 ℃下蒸干，然后重溶于10 mL甲醇/水(1:9, v/v)备用。

固相萃取(SPE)过程使用一根Waters HLB柱进行，其步骤如下：1)使用5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇进行活化(活化速度均为3 mL/min)；2)以1.2 mL/min的速度将10 mL样品灌入SPE柱；3)使用5 mL甲醇/水(2:8, v/v)冲洗，然后真空干燥5 min；4)用10mL甲醇进行洗脱。洗脱液在温和的氮气气流下40 ℃蒸干后，重溶于1 mL乙腈/超纯水(1:1, v/v)，然后使用0.22 μm注射过滤器将液体注入自动进样器样品瓶中。

1.4 UPLC-ESI-MS-MS条件

UPLC-ESI-MS-MS系统主要包括一个Waters ACQUITY® UPLC系统与Quattro Premier tandem mass spectrometer(Waters)在线连接。实验中所用的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm × 100 mm,1.7 μ m)，柱温40 ℃。ACQUITY流动相分别为A(乙腈)与B(水)。在进样(10 μL)后，线性梯度为8 min内从20:80 A-B到95:5 A-B，然后保持2 min。然后，A的浓度减少到20%，保持2 min。整个分析时间为12 min，其中包括2 min恢复至初始流动相条件的平衡时间。在整个的色谱分离过程中，流速设定为0.25 mL/min，分析柱的柱温为40 ℃。色谱流出组分被电喷雾离子化后在多反应监测(MRM)模式下进行检测。AS和PS在离子化过程中形成正离子，而ES则会形成负离子。为满足这一需求，MS的极性转换器的开关将按照被分析目标的性质而分时段转换。干燥氮气流速为700 L/h，温度为350 ℃。碰撞气体(Ar)流速为0.12 mL/min，毛细管电压为2850 V，停留时间设定为100 ms。

1.5 确认程序

校准曲线和QC样品在连续的3个工作日内进行分析。由被分析物峰面积对表观浓度函数制得校准曲线的线性通过最小二乘法计算，线性相关系数在实验中计算。

2 结果与讨论

2.1 LC-MS-MS的优化

每一份调节溶液均采用直接注入(10 μ L/min)方式引入电喷雾离子源。MS和MS-MS中产生的主要离子分别在正离子和负离子的模式下进行鉴定。为了提高检测灵敏度，收集诊断碎片离子并且对所有的质谱参数进行优化。表1和表2为所有类固醇的母离子和子离子最适宜条件的MS-MS参数：隔离母离子的第一个四极杆电压以及使其有效碎裂的碰撞能量。在作者的研究当中，2个子离子被监测。该实验参照欧洲联合会(EU)有关鉴定标准进行，其离子化目标组分的分子当中2个MRM转换在数值范围内给出了4个点，而一个数值足以作为准确的鉴定结果。在实验中，也对通常使用的流动相条件如甲醇/水和乙腈/水体系进行了优化。从溶剂消耗和离子响应方面考虑，甲醇并不是一个较好的选择。

表1 ESI+模式下13种激素的UPLC-ESI-MS-MS分析参数＊应用于定量的离子。

表2 ESI-模式下11种激素的UPLC-ESI-MS-MS分析参数＊应用于定量的离子。

2.2 基质效应

基质效应是使用LC-MS-MS进行生物样品(如水产样品)中药物检测时出现的一个特有现象。从水产样品中与被分析物一起萃取出来的杂质，如果与被分析物在LC柱中共洗脱，就可能在电喷雾处对待分析物的离子化起到抑制或者增强作用。基质效应会降低分析的准确度和重现性。因此，在本研究中利用LC-MS-MS系统分别对采用附加的清洗步骤前后的样品抽提物进行了分析，通过对结果进行比较的方式对基质效应进行了评价。结果表明，多数目标组分的检出限(LODs)在进行SPE清洗后比未经清洗的对照组低1个数量级。

2.3 选择性和重复性

水产品当中激素的鉴定是通过每个组分的保留时间和2个离子的变化来进行。特别指出的是，一个给定的分析物中2个主要子离子的相对强度是独特的，在测试的浓度范围内几乎不会随着浓度的变化而改变，因此可以藉此确定样品当中某种被分析物的存在。离子强度变化在20%以内通常认为是可以接受的。

2.4 定量限和线性

通过采用外标法6个点获得的标准曲线来进行定量分析，质量浓度范围为1～50 ng/L。该曲线通过绘制分析物峰面积的比率得到。在特定浓度范围内可以得到非常好的线性，所有鉴定样品的相关系数在0.983到0.991之间。该标准曲线适用于日内和日间检验和稳定性测试过程样品中所有组分的定量。24种激素的定量限(LOQs)在0.3～1.0 μg/kg之间。

2.5 精密度和准确性

日内和日间的准确性和精密度通过在不同天中的3次分析得到。每次分析均在相同QC浓度下平行重复6次。QC样品的日内和日间分析的精密度值(相对标准偏差) 分别为4.5%～8.8%和7.9%～10.8%。该方法显示其准确度在16%以内。这些数据在生物分析鉴定当中属于可接受的范围。

2.6 稳定性

初步研究结果表明在该研究使用的实验条件下激素是比较稳定的。对冷冻-解冻过程、连续进样和长期稳定性进行了评价，结果比较满意。当样品置于室温40 h、84 h内3次冷冻-解冻过程以及样品在－20 ℃条件下冷冻30 d的条件下，被分析物仍然保持稳定。通过在10 ℃条件下自动进样器中放置30 h来对样品处理过程中的稳定性进行测试，在这一过程中，待测激素并未发生降解，其回收率在76.4%～89.3%之间。在基质中待测激素起始浓度平均为76%左右可以被认为是稳定的。

2.7 分析方法应用

对从当地市场购买的实际样品采用上述方法进行检测。在60份样品中，双酚A在其中20份样品中被检测到，其质量浓度范围在0.5～6.2 μg/kg之间。双酚A因其具有导致动物内分泌失调的潜在活性[25,26]已经成为一种在环境研究中众所周知的目标分子。小虾样品的总离子流色谱图和离子色谱图如图2所示。其2个转换离子也在监测范围之中。所有离子保留时间和色谱峰面积比与标准值相比，均满足EU分析标准[27－29]。

图2 样品前处理方法和仪器分析条件进行系统优化后小虾样品的总离子流色谱图和离子色谱图。

3 结论

本文建立的鉴定和定量水产样品中激素的分析方法检出限可达μg/kg级水平。与传统的液相色谱相比，UPLC运行时间短，每个样品分析只需要12 min，这使得所建立的方法对激素分析更具吸引力。该方法被证明具有很好的灵敏度、线性、精密度和准确性，可应用于水产品中的激素检测。

[1]Li J, Al-Azzawi F. Mechanism of androgen receptor action.Maturitas, 2009, 63(2): 142–8.

[2]Spencer J L, Waters E M, Romeo R D, Wood G E, Milner T A,McEwen B S. Uncovering the mechanisms of estrogen effects on hippocampal function. Frontiers in Neuroendocrinology,2008, 29(2): 219–37.

[3]Bitzer J. Progesterone, progestogens and psychosomatic health of the climacteric woman. Maturitas, 2009, 62(4): 330–3.

[4]LaCroix-Fralish M L, Tawfik V L, DeLeo J A. The organizational and activational effects of sex hormones on tactile and thermal hypersensitivity following lumbar nerve root injury in male and female rats. Pain, 2005, 114(1-2): 71–80.

[5]Miura S, Nakamura S, Kobayashi Y, Piferrer F, Nakamura M.Differentiation of ambisexual gonads and immunohistochemical localization of P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme during gonadal sex differentiation in the protandrous anemonefish,Amphiprion clarkia. Comparative Biochem Physiol, 2008,149(1): 29–37.

[6]Devlin R H, Nagahama Y. Sex determination and sex differentiation in fish: an overview of genetic, physiological, and environmental influences. Aquaculture, 2002, 208(3-4): 191–364.

[7]Honkanen J O, Holopainen I J, Kukkonen J V K. Bisphenol A induces yolk-sac oedema and other adverse effects in landlocked salmon (Salmo salar m. sebago) yolk-sac fry. Chemosphere,2004,55(2): 187–96.

[8]Morgado I, Campinho M A, Costa R, Jacinto R, Power D M.Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicol, 2009, 92(4):271–80.

[9]Lundberg U. Stress hormones in health and illness: the roles of work and gender. Psychoneuroendocrinology, 2005, 30(10):1017–21.

[10]Coney P, Washenik K, Langley R G B, DiGiovanna J J, Harrison D D.Weight change and adverse event incidence with a low-dose oral contraceptive: two randomized, placebo-controlled trials.Contraception, 2001, 63(6): 297–302.

[11]Devlin P S, Sainath S B. Hyperglycemic hormone in freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii: purification from eyestalk nervous tissue and quantification by ELISA in hemolymph following various stresses. Aquaculture, 2009, 286(3-4): 290–5.

[12]Hayashi Y, Matsuda R, Maitani T, Ito K, Nishimura W, Imai K,Maeda M. An expression of within-plate uncertainty in sandwich ELISA. J Pharm Biomed Anal, 2004, 36(1): 225–9.

[13]Meng R, Xia W L, Sandberg M, Stephens R, Weber S G. Online preconcentration of thyrotropin-releasing hormone (TRH)by SDS-modified reversed phase column for microbore and capillary high-performance liquid chromatography (HPLC). J Chromatogr A, 2005, 1071(1-2): 179–84.

[14]Loureiro R F, Oliveira J E, Torjesen P A, Bartolini P, Ribela M T. Analysis of intact human follicle-stimulating hormone preparations by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A, 2005, 1136(1): 10-18.

[15]Miyazaki M, Mao L X, Henderson G, Laine R A. Liquid chromatographyelectrospray ionization-mass spectrometric quantitation of juvenile hormone III in whole body extracts of the Formosan subterranean termite. J Chromatogr B, 2009, 877(27): 3175-80.

[16]Gamble T N, Seto C, Fernandes D, Ellis R, Sakuma T. Dualcolumn high-pressure LC/MS/MS analysis of over 20 sex hormones.Clin Biochem, 2008, 41(14-15): 1275-6.

[17]Bianchi F, Careri M, Mangia A, Musci M, Santini S E, Basini G. Porcine follicular fluids: comparison of solid-phase extraction and matrix solid-phase dispersion for the GC-MS determination of hormones during follicular growth. J Pharm Biomed Anal,2007, 44(3): 711-17.

[18]Yang L H, Luan T H, Lan C Y. Solid-phase microextraction with on-fiber silylation for simultaneous determinations of endocrine disrupting chemicals and steroid hormones by gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr A, 2006,1104(1-2): 23-32.

[19]Heeft E V, Bolck Y J C, Beumer B, Nijrolder A W J M, Stolker A A M, Nielen M W F. Full-scan accurate mass selectivity of ultraperformance liquid chromatography combined with time-offlight and Orbitrap mass spectrometry in hormone and veterinary drug residue analysis. J Amer Soc Mass Spectrom, 2009, 20(3):451-63.

[20]Sun, L.; Yong, W.; Chu, X.G.; Lin, J.M. Simultaneous determination of 15 steroidal oral contraceptives in water using solid-phase disk extraction followed by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 2009, 1216(28),5416-23.

[21]Bizec B L, Pinel G, Antignac J P. Options for veterinary drug analysis using mass spectrometry. J Chromatogr A, 2009,1216(46): 8016-34.

[22]Malone E M, Elliott C T, Kennedy D G, Regan L. Development of a rapid method for the analysis of synthetic growth promoters in bovine muscle using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta, 2009, 637(1-2): 112-20.

[23]Leeuwen S M, Tan B, Grijpma D W, Feijen J, Karst U. Characterization of synthetic block copolymers by LC-MS. Am Lab, 2008, 40(3):36-9.

[24]Castro J, Balarama Krishna M V, Kenneth Marcus R. Liquid chromatography-particle beam/mass spectrometry analysis of botanical products using both electron impact and glow discharge ionization sources. Am Lab, 2008, 40(4): 8-10.

[25]Fan J, Guo H Q, Liu G G, Peng P A. Simple and sensitive fluorimetric method for determination of environmental hormone bisphenol A based on its inhibitory effect on the redox reaction between peroxyl radical and rhodamine 6G. Anal Chim Acta,2009, 35(7): 1096-1107.

[26]Watabe Y, Kondo T, Morita M, Tanaka N, Haginaka J, Hosoya K. Determination of bisphenol A in environmental water at ultra-low level by high-performance liquid chromatography with an effective online pretreatment device. J Chromatogr A,2004, 1032(1-2): 45-9.

[27]Arroyo D, Ortiz M C, Sarabia L A, Palacios F. Determination and identification, according to European Union Decision 2002/657/EC, of malachite green and its metabolite in fish by liquid chromatographytandem mass spectrometry using an optimized extraction procedure and three-way calibration.J Chromatogr A, 2009, 1216(29): 5472-82.

[28]Magrans J O, Prados J L A, Baudin J M G. Importance of considering pesticide stereoisomerism-proposal of a scheme to apply Directive 91/414/EEC framework to pesticide active substances manufactured as isomeric mixtures. Chemosphere, 2002, 49(5):461-9.

[29]Karabelas A J, Plakas K V, Solomou E S, Drossou V, Sarigiannis D A. Impact of European legislation on marketed pesticides -a view from the standpoint of health impact assessment studies.Envir Int, 2009, 35(7),:1096-1107.