芳香族羧酸的液相色谱分析进展

杨媚 吴艳征

（1 哈尔滨师范大学 2 上海实验中学剑桥教育中心)

1 引言

芳香族羧酸是有机酸中重要的一部分，它们在食品、药物等生活和生产中有着很重要的应用，因此鉴定、分离和定量分析芳香族羧酸是非常必要的。目前对于脂肪酸及无机酸的分离方法较多，而分析芳香族羧酸的报道相对较少。芳香族羧酸常用到的分离方法有气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳和离子交换色谱等[1,2,3]。本文将着重对芳香族羧酸的液相色谱分析方法进行系统阐述。

2 芳香族羧酸的反相液相色谱分析

反相色谱法（RPC）一般采用非极性固定相(如C18、C8)，流动相为水或缓冲液。常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保留时间，主要适用于分析非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。当采用RPLC法分离有机酸混合物时[5]，流动相的组成和性质对色谱保留行为有重要的影响，一些学者考察了流动相中pH值、各组分体积分数及流速对分离结果的影响，以便寻找最佳分离条件。

例如，芳香族羧酸中的苯甲酸在食品、药品、化妆品等生活用品中常被作为防腐剂的主要成分。一些学者采用反相液相色谱对苯甲酸进行了检测（见表1）。

酚酸类物质是酚类物质的一种，多为对羟基苯甲酸和对羟基肉桂酸的衍生物，具有营养和抗氧化等药理活性和药用价值，与人体健康密切相关[18,19]。Hakkinen S[20,21]用ODSHypersil柱以磷酸二氢铵：正磷酸：磷酸二氢铵与乙腈混合液为流动相分离浆果内的阿魏酸、咖啡酸在内的6种酚酸，之后分析了蓝莓果实。而在对酚酸的高效液相检测上Neira[22]等采用反相Nova Pack C18,乙腈：水：乙酸流动相，分离了没食子酸等8种酚酸。索志荣[23]等采用反相高效液相色谱简化学检测法，用甲醇-2%醋酸为流动相，建立了测定葡萄酒中4种酚酸的色谱电化学分析方法，并用该方法测定了5种国内不同品牌的葡萄酒。翁芳华[24]等以甲醇-乙酸-水溶液为流动相，建立了一种新的同时测定蓝莓酒中没食子酸等11种酚酸含量的高效液相色谱法，并测定了蓝莓酒发酵样中酚酸的含量。

3 芳香族羧酸的反相离子对液相色谱分析[4]

70年代末以来，离子对这最初被用于提高溶剂萃取的选择性的技术被引入到反相色谱中，用于有机酸和有机碱的分离，使得反相色谱分离分析技术的应用领域大为扩展。近年来，离子对色谱法又被逐步用于无机阴离子和阳离子络合物的分离分析中。可以说离子对色谱法是反相色谱技术和离子色谱法技术的引申和发展，已成为一种广泛采用的液相色谱分离方法。

离子对反相色谱（RP-IP）和反相液相色谱中分离过程中所采用的柱和流动相很相似[4]，不同的主要是离子对反相色谱的流动相中加入了离子对试剂。其原理是将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。离子对试剂的结构和浓度也会影响样品的保留值。

E. G. Sumina[25]等人利用反相离子对薄层色谱法和高效液相色谱法对苯甲酸进行了检测，得到了较满意的分析结果。伍发兴[26]采用离子对色谱法，在zorbax Eclipse XDB-C8柱上，快速测定含乳饮料中的糖精钠、苯甲酸和山梨酸的三种食品添加剂含量。在试验浓度范围5～200mg／L内均呈良好线性。三种添加剂的检测限分别为5ng、4ng、4ng。杨晓莉[27]等利用反相离子对高效液相色谱梯度洗脱建立复方硝酸益康唑乳膏含量测定的方法。色谱柱为辛烷基硅烷键合硅胶柱，检测波长227nm，内标物质为对羟基苯甲酸乙酯。本法可同时测定复方硝酸益康唑乳膏中硝酸益康唑、曲安奈德、苯甲酸的含量。

4 芳香族羧酸的离子（交换）色谱分析

离子交换色谱的分离机理主要是离子交换，是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的离子之间进行的可逆交换。是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换反应是可逆反应，这种反应是在固态的树脂和水溶液接触的界面间发生的。在水溶液中，连接在离子树脂骨架上的功能基能离解出可交换的离子B+，该离子在较大范围内可以自由移动，并能扩散到溶液中。同时，溶液中的同类型离子A+也能扩散到整个树脂结构内部，这两种离子之间的浓度差推动着它们之间的交换。其浓度差越大，交换速度就越快。离子交换色谱在分离低分子有机酸方面，无须对样品进行复杂的预处理，能够很好地分离和同时检测多种有机酸物质[28]。

许龙福[29]探讨了用强阳离子交换柱同时测定食品中糖精、苯甲酸、山梨酸、柠檬酸及苹果酸的可行性。以c(1/2 H2SO4)=0.0005ml/L作流动相，在230nm下分离测定。可完全分离测定上述5种添加剂，相关系数在0.9993以上，乳化剂及甜味素不干扰。可用强阳离子交换柱代替反相柱同时测定以上5种添加剂，应用于果奶等测定结果满意。

分析芳香族羧酸更多时候采用某些强阴离子交换色谱柱。早在1974年，Kil Sang. Lee[30]等人就采用阴离子交换色谱法测定了水杨酸和它的衍生物。郜志峰[31]采用阴离子分析柱，淋洗液为0.75mmol/L邻苯二甲酸测定农药绿康宁中的苯甲酸和硫酸根离子，可同时分析有机酸和无机阴离子。徐海波[32]、陈利根[33]等分别对上述离子交换色谱的条件做了进一步的优化和探讨。M. A. M. Aboul-Soud[34]等人采用高效离子交换色谱法对水杨酸进行了检测，亦取得了较好的分析结果。2005年，钟志雄[35]等采用离子交换-电导检测离子色谱法测定食品中的甜蜜素和苯甲酸。选用25.0mmol/L NaOH+5%甲醇淋洗液，外接水自动再生，样品经沉淀处理，过滤后进样分析。该方法的线性范围广、相关性较好。2008年，张嘉捷[36]等鉴于离子交换色谱中被测离子和有机聚合物树脂之间存在的吸附作用，选择阴离子交换色谱柱，针对离子交换色谱中的吸附保留行为，从色谱混合保留机理的角度出发，以含50%乙腈(V/V)的9mmol/L Na2CO3为流动相，对12个不同结构类型的无机和有机阴离子(氟离子、氯离子、硫酸根、磷酸根、二羟基丁酸、丙酮酸、乙酸、丙烯酸、苯甲酸、丙二酸、酒石酸和邻苯二甲酸)的保留行为进行研究，并采用推导所得的混合保留机理模型对溶质这一保留特征进行表征，结果较为理想,为离子交换色谱中吸附保留行为的研究提供了新方法。

目前，离子交换色谱的使用与其它色谱相比可能不是那么频繁[4]，虽然很多时候离子对液相色谱由于其柱子的高效性、易控制等因素使用起来更为方便，但当有机离子有较弱的紫外吸收或需要电导检测时，更多时候选择离子交换色谱。

5 芳香族羧酸的离子排斥色谱分析

离子排斥色谱是在离子交换色谱法前就由Wheaton和Bauman于 l953年提出来的

分离技术。在 l975年离子交换色谱法问世之后 ，该技术又重新引起人们的重视。近年来离子排斥色谱主要应用于分离测定弱离解的有机酸、无机酸及某些分子型样品。随着分析方法的改进，相关的文献报道也逐渐增多。离子排斥色谱法能够应用的主要原因是[37]：①极适合于含水基体；②对强亲水性和强挥发性的物质不会造成损失；③只需简单的样品前处理，不需柱前衍生作用；④有机酸的分析几乎不受无机阴离子的干扰；⑤可联合其它的色谱分析方法，实现二维分离。

离子排斥色谱的分离理论是由Donnan排斥原理发展而来的[37]。IEC的分离柱填料一般是有一定交联度的（8%）、总体磺化的H+型高容量阳离子交换树脂。树脂的电荷密度较大，导致在树脂颗粒间隙的液体和树脂微孔内吸留的液体间形成一个“半透膜”。溶质阴离子（如Cl-）由于受Donnan排斥，不能进入树脂微孔内，因此不被保留，而非离子型的中性分子，如有机酸、醇类等，则不受Donnan排斥的影响，可通过“半透膜”进入树脂的微孔内，有保留作用。此方法可成功地分析无极弱酸（如硼酸、氟、亚砷酸、氢氰酸、氢碘酸、硅酸、亚硫酸和碳酸）和大量有机酸，也可用于醇类、醛类的分析。

现代排斥色谱理论是1978年Turkelson等提出的[38]。他们用稀酸代替水作流动相，由于低pH值的洗脱液抑制酸的离解，这时pK1小于洗脱液pH值的组分被排斥不进入膜内，反之被保留。洗脱液的pH值越低，即其酸浓度越高，保留时间越长。有机酸的保留主要受酸离解程度(pKa值)影响[39,40]，同时也受酸在固定相上吸附分配的影响[40]。有作者指出[41]，待测有机酸的pK1只有2.7～5才能被较好地分离。在性质相似的酸中，pK1越大，洗脱越慢，即保留体积越大。例如容易离解的有机酸在柱上保留弱，则保留时间短，先流出；不易离解的有机酸，在柱上保留时间长，后流出。

Ng等人[42]在三种不同强酸型阳离子交换剂固定相上（磺化的聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、硅基），使用14种不同pH值的淋洗液，得到了13种选定羧酸(包括一元、二元脂肪酸和芳香酸的保留数据)。结果显示，疏水性吸附作用对IEC法分析含三个及三个以上碳原子的一元脂肪酸和芳香酸起主要作用。李海燕[43]以0.005mmol/L硝酸为淋洗液，用电导离子排斥色谱法测定饮料中作为防腐剂的苯甲酸，在H+型阳离子交换树脂得到苯甲酸与饮料中其它组分的良好分离。对普通样品只需经过稀释即可进行进样，分析时间很短（小于6分钟）。2008年，于泓等人[44]研究了直接电导检测-离子排斥色谱法分离测定芳香族羧酸（邻苯二甲酸、水杨酸、苯乙酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸和邻甲苯甲酸）。以Shim-pack、SCR-102H色谱柱为分离柱，H2SO4为流动相，考察了流动相浓度、色谱柱温度、流速对分离和测定芳香族羧酸的影响。本方法用于酱油样品的分析得到满意结果。2009年，肖坤[45]等人以硝酸为淋洗液，应用离子排斥色谱法测定了饮料中的苯甲酸含量，样品预处理简单，分析时间较短，该方法的灵敏度满足实际测定要求。然而，也有些芳香族羧酸用常规离子排斥色谱法检测是比较困难的。因此Tanaka等人[46]提出了一种IEC新方法---“反离子排斥色谱法”（Vacancy Ion –Exclusion ChromatograpHy）。Ohta等[47]研究了芳香族羧酸在几种阴离子交换树脂柱上用H2SO4作淋洗液的离子排斥色谱分离，Helaleh等[48]研究了用反离子排斥色谱将样品溶液作流动相，含甲醇的水溶液作试样，在弱酸阳离子交换树脂柱上分离了硫酸、萘四羧酸、邻苯二甲酸和苯甲酸，结果令人满意。

6 结束语

反相液相色谱、反相离子对色谱、离子（交换）色谱及离子排斥色谱的应用和结合，扩大了液相色谱法在有机酸测定方面的应用，为分离和测定芳香族羧酸提供了很好的选择。由于这几种方法有多种分离方式和多种性能各异的色谱柱可供选择，又可选择不同的流动相，不仅使芳香族羧酸的分析具有较高的灵敏度和较好的选择性，而且改进了分析复杂样品的能力。

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