格里菲斯肺炎双球菌转化实验的细胞机制

王 妍 沈 帆

(南京师范大学教师教育学院 210009)

李建宏*

(南京师范大学生命科学学院 210046)

1 肺炎双球菌

肺炎双球菌(Streptococcuspneumoniae)是革兰氏阳性菌，属链球菌科链球菌属，是兼性厌氧链球菌。在19世纪末期，肺炎双球菌被认定为是导致肺炎的一大原因，是许多体液免疫研究的主题。肺炎双球菌可无症状驻留在健康带菌者的鼻咽部、呼吸道，鼻窦和鼻腔是通常被感染的部分。然而，对于易感人群(如免疫力低下的老年人和儿童)，它们有可能成为致病性因素[1]。它们拥有的多糖荚膜充当着生物体毒力因子，根据荚膜多糖抗原的不同，可将其分为90多种不同的血清型，不同的类型毒力、发病率和耐药性的程度不同[2]。

根据肺炎双球菌的菌落特征，肺炎双球菌分为两种类型：光滑型(S)和粗糙型(R)。S型细菌的菌体是有荚膜的，通常有毒性，而R型细菌无荚膜，无毒性。这里所说的毒性并不是说荚膜有毒性，荚膜只是细菌细胞壁外的一层较松厚且较固定的粘性物质，主要由水、多糖或多肽组成[3]。这层荚膜，可作为S型菌的保护层，在侵染的生物体内，可以抵抗吞噬细胞的吞噬和消化作用，从而能够迅速繁殖、扩散，引起机体发生疾病。而R型菌无荚膜，可被吞噬细胞吞噬，不会导致机体患病。所以细菌是否致病，关键是看有无荚膜。

2 肺炎双球菌的转化过程

1928年格里菲斯用肺炎双球菌在小鼠身上进行了转化实验。对于实验产生的现象，格里菲斯认为：S型死菌细胞中有某种物质进入R型活菌细胞，从而使R型菌转化为S型菌。后来艾弗里等人用生物化学方法明确这种物质是DNA。

那么S型菌的哪段DNA进入R型菌了呢？尽管肺炎双球菌的种类很多，但经过测序发现荚膜基因的位点几乎都位于染色体上的dexB基因与aliA基因之间[4]。在dexB和aliA基因之间，包含编码荚膜合成的相关基因，包括多糖的合成、转运、与脂质载体连接等过程所需要酶的基因，形成的荚膜可以保护肺炎链球菌逃避补体介导的中性粒细胞的吞噬作用，有助于细菌在宿主中存活。由此可以确定，格里菲斯实验中转入R型菌的是S型菌染色体上的带有荚膜基因的DNA片段。

在肺炎球菌转化过程中，外部的DNA片段是怎么进入R型菌的呢？这其实是一个细菌的自然转化过程——具备自然转化能力的细胞可以自发地从外界获取DNA，其中具备摄取外源DNA能力的细胞被称为感受态细胞。这个转化的过程大致分为三步：首先，R型菌成为感受态细胞，接着感受态细胞摄取外源DNA，最后外源DNA在该细胞中进行同源重组。

2.1 R型菌成为感受态细胞 成为感受态细胞是摄取外源DNA的前提。肺炎双球菌感受态的调控主要涉及五个蛋白(ComABCDE)，它们共同组成一个群体感应系统。ComC编码感受态信息素(CSP)前体，当细胞外CSP积累到可以发生感受态临阶浓度时，与膜结合蛋白ComD结合使其磷酸化，当磷酸基团转移到ComE上，它被激活并刺激大约20个早期感受基因转录，包括编码ComABCDE的基因、sigma因子ComX和免疫蛋白ComM。ComABCDE表达的增加，形成了一个自动催化回路，使细胞进入感受态[5]。

2.2 摄取外源DNA 由于高温加热S菌，使其死亡，所以细胞破裂，细胞内的DNA被释放出来。此时，R型菌感受态细胞产生转化菌毛，它可以结合双链DNA，从而使其穿过R菌的细胞壁和细胞膜[6]。当然这只是一种假设，还需要更多的证据来证明。在细胞膜上相关的核酸内切酶降解双链中非转化的一条DNA单链，同时，那条互补链进入细胞质[7]。单链DNA进入与降解的过程几乎是同步进行的。

2.3 外源DNA进入细胞并进行同源重组 进入R菌细胞质的单链DNA片段被SsbB(单链DNA结合蛋白)包裹，以防其被核酸酶降解，并为重组做好准备[5]。因为R菌的基因组与转化进来的S菌单链DNA有很多同源的区域，所以被转化进来的单链DNA可以整合到R菌的染色体上，从而使R菌的基因组发生改变，由于重组的这段DNA片段携带荚膜基因，所以使R型菌恢复了产生荚膜的能力，这样经过细胞分裂产生的子代细胞就会产生荚膜，成为S菌。

3 外源DNA进入受体细菌细胞的方式

细菌摄入外源DNA主要有三个方式：转化、接合、转导[8]。格里菲斯的实验就是转化实验。在自然情况下，某些细菌溶解以后释放的DNA不通过其他媒介被其他细菌吸收而发生转化。现在我们说到的转化，经常是指基因工程实验过程中，从细菌里面纯化的 DNA 分子直接导入遗传性状相异的细菌，如质粒转化用的是纯化的质粒 DNA 本身，没有任何媒介帮助。从这个概念的内涵来说，只要 DNA 进入细菌，就完成了转化过程，这里不涉及转化的 DNA 是否复制，也不涉及是否改变细菌的遗传性状，以及外源基因是否表达等。进入受体细胞的外源DNA要通过复制、基因表达、或者整合进受体菌的染色体，才最终完成转基因的过程。

接合是在细胞与细胞接触时发生的，两个细胞接触处形成结合通道，单链DNA可以通过这个通道从一个细胞转移到另一个细胞。最先被发现在细菌接合作用时被转移的质粒是大肠杆菌Escherichiacoli的F因子，一种微小的质粒，不是每个细菌细胞中都含有这种游离的F因子，只有供体细胞才有F因子，这种菌株被称为F+，受体细胞没有F因子，这种菌株称为F-。F+细胞利用性菌毛识别F-细胞并进行细胞膜的融合，形成细胞质桥。F因子是环状双链DNA，在转入之前，其中的一条单链被切开，以切口为起点，将此单链传到F-细胞，然后以单链为模板合成完整的F因子。通过接合作用受体细胞可以得到不同的抗性基因或新的代谢基因组，从而在不同的环境下生存。

转导是指通过病毒将一个细菌的DNA转移到另一个细菌的细胞中而引起的基因重组现象。转导这个概念涉及三个关键点：病毒、宿主DNA、整合。转导通常以噬菌体为媒介，用噬菌体的外壳将外源DNA包裹进去，成为有活力的噬菌体，然后以感染的方式将DNA转移到另一个细菌，从而使目的基因在该菌中复制繁衍。噬菌体转导技术提高了外源DNA转入细菌的效率，经常被用于DNA文库的建立。

4 总结

对于格里菲斯的肺炎双球菌转化实验，实验已经明确揭示进入到R型菌并与染色体发生重组的是S型菌的染色体DNA片段。S菌的DNA进入R型菌的前提是R型菌为感受态细胞，在此情况下，R菌可以摄取S菌的DNA片段，并通过各种调控机制使S菌的DNA以单链的形式进入，进入R菌细胞的DNA片段最终与R菌的染色体发生同源重组，转变为具有产荚膜能力的S菌。

(*通信作者)