肠出血性大肠杆菌z4832基因缺失突变株的构建

谭林林，王建新，李 涛，王 慧

肠出血性大肠杆菌z4832基因缺失突变株的构建

谭林林1，2，王建新2，李 涛2，王 慧1，2

目的 利用Red重组系统的同源重组功能，敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7（EHEC O157∶H7）的乙酰转移酶基因z4832，构建z4832基因缺失突变株。方法 EHEC O157∶H7的基因组作为模板，PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列；将上下游同源臂连接于pUC19-kana质粒上卡那霉素（kana）抗性基因的两端；PCR扩增获得中间嵌合卡那霉素抗性基因的同源臂线性片段，利用质粒pKD46介导的重组技术敲除z4832基因，利用pCP20质粒介导的重组技术去除抗性标记。PCR扩增及DNA测序验证目的基因缺失后，测定突变株及野生株的生长曲线，检测在抗菌药物氧氟沙星中的存活率。结果 成功构建EHEC O157∶H7 z4832基因缺失突变株。z4832缺失突变株生长速度与野生株差异无统计学意义，但在含氧氟沙星的LB培养基中突变株存活率升高（P＜0.05），在含氧氟沙星的M9培养基中存活率下降（P＜0.05）。结论 构建z4832缺失突变株，研究z4832与肠出血性大肠杆菌耐药性之间的关系，为进一步研究乙酰转移酶在EHEC O157∶H7中的作用机制奠定了基础。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7；Red重组系统；乙酰转移酶；抗生素

肠出血性大肠杆菌（EHEC）是主要的食源性致病菌之一，通过粪便或屠宰过程污染饮水和肉类及其他食品，并且可以在水果蔬菜中长期存活［1］。由其引发的食物中毒在世界各地均有过暴发流行［2］。人感染该病原菌后可引发溶血性尿毒综合征（heomlytic uremic syndrome，HUS）及血栓性血小板减少紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等严重并发症［3］。生物信息分析结果显示EHEC O157∶H7基因组中z4832基因所编码蛋白为乙酰转移酶。蛋白质乙酰化修饰因为被发现参与转录、代谢等多个重要领域而受到广泛关注和研究［4-6］。经预测，z4832基因属于GNAT家族。GNAT家族在生物界广泛存在，能够把乙酰辅酶A的乙酰基转移至乙酰基受体上，通过改变小分子或者蛋白质的结构和功能从而发挥生理功能［7-10］。该研究利用Red同源重组系统，敲除EHEC O157∶H7的乙酰转移酶基因z4832，构建z4832基因缺失突变株；结果表明，z4832基因缺失突变株在含有氧氟沙星的培养基中存活率发生改变。这为将来研究EHEC的致病机制提供了依据和材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 EHEC O157∶H7 EDL933菌株、pCP20质粒、pKD46质粒、插入卡那霉素（kana）抗性基因的质粒pUC19-kana由军事医学科学院保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞、pEASY-T1 simple载体和大肠杆菌BL21（DE3）表达感受态细胞购自北京TransGen生物技术有限公司。

1.1.2 引物设计 PCR引物由中美泰和生物技术有限公司合成（表1），其中U1-HindⅢ、U2-SalⅠ用于扩增z4832基因上游500 bp同源臂（z4832-up）；D1-BamHⅠ、D2-EcoRⅠ用于扩增z4832基因下游500 bp同源臂（z4832-down）；kana-SalⅠ、kana-BamHⅠ用于扩增kana基因（带有FRT位点）。

表1 引物序列

1.1.3 主要试剂 基因组提取试剂盒购自美国Promega公司；TransStart Taq DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒购自北京TransGen生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶均购自美国NEB公司；2 mm电转杯购自美国BIO-RAD公司。

1.1.4 主要仪器 恒温振荡摇床购自太仓市实验设备厂；PE-2400 PCR扩增仪购自美国PE公司；Scp85H高速冷冻离心机购自日本HITACHI公司；SpectroPlus全自动酶联免疫检测仪购自美国MD公司；GenePulser Xcell电穿孔仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 构建z4832打靶片段 以提取的EHEC O157∶H7 EDL933菌株基因组作为模板，以U1-HindⅢ和U2-SalⅠ为引物PCR扩增z4832基因上游的500 bp同源臂序列，以D1-BamHⅠ和D2-EcoRⅠ为引物PCR扩增z4832基因下游的500 bp同源臂序列。用PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物，然后与克隆载体pEASY-T1 simple连接，分别获得pEASY-T1-z4832-up质粒和pEASY-T1-z4832-down质粒；将两种质粒以及pUC19-kana分别转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。分别构建pEASYT1-z4832-up/DH5α、pEASY-T1-z4832-down/DH5α、pEASY-T1-kana/DH5α菌株，并从中提取pEASYT1-z4832-up质粒、pEASY-T1-z4832-down质粒、pUC19-kana质粒。

用HindⅢ和SalⅠ限制性内切酶双酶切pEASY-T1-z4832-up质粒；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶双酶切pEASY-T1-z4832-down质粒；SalⅠ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切pUC19质粒。上下游同源臂分别连接至kana的两侧，构建pUC19-z4832-up-kana-z4832-down质粒。提取该质粒，用引物U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ扩增UKD打靶片段，用DpnⅠ内切酶处理，纯化回收，获得线性打靶片段。

1.2.2 pKD46质粒导入EHEC O157∶H7 将EHEC O157∶H7菌株接入新鲜的LB培养基中培养过夜，复苏菌株。将复苏的EHEC O157∶H7按1∶100的比例接入10 ml新鲜LB培养基中，37℃、2 00 r/min条件下培养至光密度（optical density，OD）值OD600mm约为0，4时取出，冰浴10 min。4 000 r/min、4℃条件下离心2 min，富集菌体。用冰冷的10%甘油洗涤3次菌体，每次离心条件均为4 000 r/ min、4℃、2 min。将菌体溶解到100 μl 10%甘油中制成感受态细胞。向感受态细胞中加入pKD46质粒，2.5 kv、200 Ω、25 μF电击，然后加入1 ml冰冷的LB培养基。将电转杯封口，在30℃、2 00 r/min条件下培养1 h，取500 μl菌体涂于含100 μg/ml氨苄青霉素的LB平板，30℃培养，次日挑取单克隆，经PCR鉴定构建pKD46/EHEC菌株。

1.2.3 z4832目的基因的敲除 将pKD46/EHEC菌株于30℃、200 r/min过夜复苏。次日按1∶100的比例转接于10 ml新鲜LB培养基中30℃、200 r/ min培养，待菌液OD600nm到达0.3时，添加L-阿拉伯糖至终浓度为30 mmol/L，继续培养1 h，待OD600nm约为0.6时取出。冰浴10 min，4℃、5 000 r/min离心2 min收集菌体，相同的离心条件下用蒸馏水洗菌体3遍，10%甘油洗3遍，最后用100 μl、10%甘油重悬菌体，4℃放置15 min即制得感受态细胞。向感受态细胞中加入100 ng纯化后的线性打靶片段，混匀后冰浴15 min，然后将混合物转移至预冷的电转杯中，在电压2.5 kV，电阻200 Ω，频率25 μF条件下电击。电击后加入1 ml冰冷的LB培养基，37℃、200 r/min条件下培养1 h。吸取500 μl菌液涂布含50 μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。次日挑取单克隆，U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ引物PCR鉴定打靶片段正确重组菌即为目的基因缺失的阳性克隆，其中kana基因置换z4832基因。

1.2.4 卡那霉素抗性基因的消除 将已经敲除目的基因的阳性克隆传代3次，37℃、200 r/min培养，待菌液OD600nm到达0.6时，按照1.2.3中方法制备感受态细胞，加入200 ng pCP20质粒，冰浴15 min，然后电击转化，电击之后立刻加入1 ml冰冷的LB培养基。封闭电转杯，30℃、200 r/min培养1 h。取200 μl菌液涂布含100 μg/ml氨苄霉素的LB平板，30℃倒置培养过夜，次日挑取单克隆，U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ引物鉴定阳性克隆，将卡那抗性基因丢失的阳性克隆转接于新鲜LB培养基中，42℃、200 r/min继续培养过夜，次日将菌液适当稀释后涂布LB平板，37℃培养过夜。挑取单克隆分别在含100 μg/ml氨苄霉素的LB平板和50 μg/ml卡那霉素LB平板上划线培养。对在两种含抗生素的平板上均不生长的克隆，进行基因组定位测序。其中不具有pKD46和pCP20质粒的菌株即为z4832基因缺失突变株。

1.2.5 野生株及缺失突变株生长曲线的测定 将过夜培养的EHEC O157∶H7野生株和z4832基因缺失突变株按1∶100的比例接种至200 ml培养瓶中。37℃、200 r/min培养。每隔1 h测定1次OD600nm。每株菌做3个平行。将所得数据绘成生长曲线。

1.2.6 野生株及缺失突变株在含氧氟沙星的M9和LB培养基中存活率的测定 将EHEC O157∶H7野生株和z4832基因缺失突变株复苏后按1∶100接种到5 ml LB或M9培养基内。37℃、200 r/min摇至OD600nm约为0.5时取出500 μl加入到500 μl含10 μg/ml氧氟沙星的LB或M9培养基内，37℃、200 r/min培养5 h后取出，13 000 r/min离心5 min，收集所有菌液。PBS洗1次后，取适量稀释后涂LB平板，37℃培养16 h，每个浓度和稀释度各3个平行。根据平板上的细菌克隆数计算存活率。只取其中克隆数在10到100个之间的平板计数。

2 结果

2.1 PCR扩增z4832基因上下游同源臂 PCR扩增z4832基因上游500 bp同源臂z4832-up和下游500 bp同源臂z4832-down（图1A）；分别酶切连接于pUC19-kana质粒kana基因的两侧，构建pUC19-z4832-up-kana-z4832-down，用引物U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ扩增出打靶片段（图1B）。

2.2 PCR鉴定目的基因缺失突变株 挑取转化打靶片段后的单克隆，以引物U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ鉴定重组菌，正确重组菌PCR产物大小为2 500 bp（图1C）。

2.3 卡那基因的敲除及鉴定 以U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ为引物鉴定kana基因敲除突变株。pCP20质粒表达的FLP重组酶识别kana基因两端的FRT位点，敲除kana基因，PCR产物大小约1 000 bp（图1D）。

2.4 野生株及z4832缺失突变株生长曲线的比较

每隔1 h测定菌液的OD600nm，监测10 h，绘制生长曲线，z4832缺失突变株与野生株生长速度差异无统计学意义。见图2。

2.5 野生株及z4832缺失株在含氧氟沙星的M9和LB培养基中存活率的比较 在含有氧氟沙星的LB培养基中z4832基因缺失株存活率比野生株高4.3倍，两者存活率差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。而在含有氧氟沙星的M9培养基中z4832基因缺失株存活率比野生株低4倍，两者存活率差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

在病原微生物研究中基因敲除是确定基因未知功能和阐明其致病机制的一种重要手段。目前Red同源重组技术已经被广泛的应用于大肠杆菌的基因敲除，该技术有同源序列短、重组效率高等特点，可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作。本研究利用该技术成功构建了EHEC O157∶H7的z4832基因缺失突变株，并且对传统的操作方法做了一些改进。感受态的制备采用现用现制备的方案，制好后4℃静置15 min后使用，此时感受态细胞活力最佳，使转化效率提高；电击转化之前的操作使用4℃预冷的枪头能够防止感受态细胞升温，保持其活力；阿拉伯糖终浓度为30 mmol/L，诱导时间为60 min，能够提高重组酶表达量；在卡那霉素基因替换目标基因后，将细菌传代3次有利于之后卡那霉素基因的去除。

GNAT家族与许多生理反应相关，包括耐药、转录调控、压力反应以及代谢等，其可以利用乙酰辅酶A乙酰化各自的底物并释放辅酶A和乙酰化的产物［11］。通过测定生长曲线发现z4832基因缺失后EHEC O157∶H7生长速度与野生株相比并无显著差异，说明其表达产物作为乙酰转移酶在细菌生理进程中的作用与生长速度无关，z4832基因的缺失并不会影响细菌的正常生长。

图1 PCR产物电泳结果

图2 野生株及z4832缺失突变株生长曲线

图3 野生株及z4832缺失突变株在含有氧氟沙星的LB培养基中的存活率

图4 野生株及z4832缺失突变株在含有氧氟沙星的M9培养基中的存活率

在含有氧氟沙星的LB培养基中z4832基因缺失突变株存活率高于野生株，而在含有氧氟沙星的M9培养基中z4832基因缺失突变株存活率却低于野生株。两者结果截然不同，说明不同的碳源影响了乙酰转移酶的作用结果，进一步推测该乙酰转移酶可能与细菌的代谢相关，其具体的作用机制将在后续工作中进一步探索。本实验构建的EHEC O157∶H7的z4832基因缺失突变株为下一步机制研究提供了材料和依据。

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Construction of z4832 defective mutant of enterohemorrhagic Escherichia coli

Tan Linlin1，2，Wang Jianxin2，Li Tao2，et al
（1Anhui Medical University，Hefei 230032；2State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071）

Objective To construct acetyltransferase defective mutant of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7（EHEC O157∶H7）with λRed recombination system.Methods Kanamycin-resistant gene with two FRT sites and homologous regions which were cloned from EHEC O157∶H7 by PCR were inserted into plasmid pUC19 to construct a recombinant vector.z4832 was deleted with the recombination function of plasmid pKD46.The kanamycin-resistant gene was deleted with the recombination function of plasmid pCP20.The gene deletion mutant was obtained and identified by PCR and sequencing.Then the growth curve was determined and the change of survival rate were checked in LB or M9 medium containing ofloxacin.Results The acetyltransferase gene z4832 defective mutantof EHEC O157∶H7 was successfully constructed.The growth curve of the mutant had no significant difference with that of wild strain.The viability of deletion mutant increased in the culture with LB medium（P＜0.05）but reduced with M9 medium（P＜0.05）.Conclusion The construction of z4832 defective mutant would be helpful for study of the effect of z4832 on antibiotic tolerance and the mechanism by which acetyltransferase works.

EHEC O157∶H7；λRed recombinant system；acetyltransferase；antibiotics

Q 939.93

A

1000-1492（2016）08-1111-05

时间：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.016.html

2016-05-04 接收

国家自然科学基金（编号：81401643）

1安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所，合肥 230032

2军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071

谭林林，女，硕士研究生；

王 慧，女，博士生导师，责任作者，E-mail：geno0109@ vip.sina.com