雌激素影响骨髓间充质干细胞BMP-2和VEGF表达的实验研究

黄海峰，孙 立，田晓滨，张 进

雌激素影响骨髓间充质干细胞BMP-2和VEGF表达的实验研究

黄海峰，孙 立，田晓滨，张 进

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨过程中雌激素对骨形态发生蛋白2（BMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，以探讨雌激素可能的成骨机制。方法 对大鼠BMSCs进行分离培养，增殖到第4代后，实施成骨诱导1周后停止，通过碱性磷酸酶（ALP）染色方法，对成骨分化程度进行鉴定。使用雌激素对细胞进行作用，分别对细胞BMP-2、VEGF、ALP的表达情况进行测定。结果 在雌激素的作用下，BMP-2 mRNA、BMP-2、VEGF蛋白和ALP蛋白表达均明显提高。结论 雌激素可能通过雌二醇的作用，促进BMP-2和VEGF蛋白的表达，使得骨的形成过程变得更为高效，因此可以判断这种物质具有骨诱导活性。

骨髓间充质干细胞；雌激素；骨形态发生蛋白2；血管内皮生长因子

雌激素替代疗法是治疗绝经后的妇女骨质疏松症最有效的方法之一。除了雌激素能够抑制骨吸收，雌激素的受体能够有效促进骨基质蛋白的形成［1］，并对骨的形成有正面促进作用［2］。骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）对于骨形成来说不可或缺，其功能在于诱导成骨的分化［3］。而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在骨修复中对血管的产生十分重要。研究［4］表明VEGF也会对成骨细胞所含有的BMP-2作用产生促进影响。骨修复时上述两种生长因子的表达上调，或许能够达到骨和血供重建的协同效应。而且骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中存在雌激素受体（ER）表达［2］，证明雌激素或许在细胞发挥生物学功能时发挥了一定的作用。雌激素作用后动物骨形成也会大幅提高［5］。该研究拟探讨雌激素促进骨形成的生物学机制，为造福患者作出贡献。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，6～8周龄，110～120 g，由贵阳医学院实验动物中心所提供。实验在《关于善待实验动物的指导性意见》［6］指导下进行。

1.2 药物和试剂 细胞完全培养液：20%胎牛血清、L-DMEM、100 U/ml青链霉素。成骨诱导培养液［7］：5%胎牛血清、L-DMEM、10 nmol/L地塞米松、100 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/ml抗坏血酸、100 U/ml青链霉素。17β-雌二醇，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色试剂盒，大鼠ALP、BMP-2、VEGF ELISA试剂盒，PCR试剂盒。

1.3 实验设计和分组

1.3.1 BMSCs的分离培养和传代 取2只大鼠断颈处死后无菌操作分离取出股骨和胫骨，用PBS冲洗出骨髓，1 700 r/min离心5 min后用L-DMEM重悬，再次1 700 r/min离心5 min，去上清液，用细胞完全培养液重悬，用培养瓶盛装。然后放置到37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里。2 d后倒除一半的培养液，并倒入等量的新的培养液，以后每3 d换液1次，当原代细胞达到80%融合时用胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，按1∶2传代培养。

1.3.2 BMSCs成骨诱导分化 取一洁净的6孔培养板，并将完成灭菌的盖玻片盖上，接着按照1× 105个/孔的标准，接种4代细胞进行培养。随机编为A组，分为对照A组和实验A组并持续观测，一旦细胞融合程度达到70%，将成骨诱导培养液添加到实验A组里面，以72 h为周期更换培养液，持续诱导1周。对照A组中添加的培养液不含有成骨诱导剂，同样以72 h为周期更换培养液，持续诱导1周。

1.3.3 ALP染色 细胞完成1周的诱导后，把培养液全部吸除，使用PBS溶液进行冲洗，3次后停止。按ALP染色试剂盒操作进行染色，标记，镜下观察。

1.3.4 雌激素处理 使用胰蛋白酶对完成1周诱导的实验A组细胞进行消化。在6孔培养板中注入低糖培养液（成分为不包括血清的L-DMEM），接着按照1×105个/孔的标准接种细胞，并随机编为B组，分为对照B组和实验B组。1 d后使用显微镜进行观察，一旦培养板内壁上出现了细胞，将17β-雌二醇添加到实验B组里面，确保培养液中雌激素浓度保持为10 nmol/L［8］，经过1 d后收集上清液和细胞，将细胞用超声波破碎仪破碎，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、ELISA法分别检测每孔总的BMP-2和VEGF、ALP的浓度。

1.3.5 BMP-2 RT-PCR电泳 提取细胞总RNA行逆转录后，行PCR（聚合酶链反应）。β-actin上游引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′；BMP-2上游引物：5′-GTCCTCAGCGAGTTTGAGTTG-3′，下游引物：5′-CAAAGCTCTCCCACTGACTTG-3′。反应条件：在94℃条件下展开变性，10 min后取出。接着按照94℃、30 s，55℃、45 s以及72℃、45 s的条件进行处理，经历40个循环，在72℃环境下多反应10 min。最后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统检测并照相进行DNA的相对定量分析。

1.3.6 ELISA法检测每孔总的BMP-2和VEGF、ALP的浓度 按试剂盒说明书操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以±s表示；采用两独立样本t检验对多组数据进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs的形态学观察 完成2 d的分离细胞培养并更换50%的培养液后，通过显微镜观察可知红细胞将培养瓶底完全覆盖，难以找到BMSCs的存在。第5天全量换液后，可以发现培养瓶壁上存在极少数的BMSCs，细胞形状主要为梭形，椭圆形或不规则型也有少量。细胞在折光性方面表现良好。经过第2次换液后，细胞分化速度呈对数规律，第3次换液后速度明显降低。第8天更换全部培养液后，使用显微镜进行观察，发现细胞大量分化，且其排列如同漩涡。第11天更换全部培养液后，细胞融合程度为80%～90%，旋涡状排列形态更为明显，分化后快速聚集成片。见图1。

2.2 完成第4代细胞成骨诱导1周后进行ALP染色结果 完成成骨诱导后，细胞染色结果显示，细胞核呈现出紫色，大量的红棕色物质存在细胞质中，充分说明ALP呈阳性。对照组ALP染色未见红棕色颗粒出现，实验组ALP染色有较多的红棕色颗粒出现。见图2。

图1 大鼠BMSCs的形态学观察

图2 ALP染色结果

2.3 BMP-2 mRNA转录水平的变化 完成凝胶电泳后，使用紫外灯进行照射，测量结果显示大鼠βactin、BMP-2分别为207、475 bp。见图3。使用凝胶成像系统针对大鼠β-actin与BMP-2 DNA目的条带进行积分光密度值的比值分析即相对定量分析。相对定量分析的值为目的基因和内参基因两者表达的比值。5个样本量结果表明对照B组积分光密度比值（0.62±0.13）小于实验B组（0.95±0.18），差异有统计学意义（t=-3.19，P＜0.05）。

图3 BMP-2 mRNA转录水平

2.4 BMP-2、VEGF蛋白水平及ALP蛋白表达的变化 应用ELISA法测定BMP-2、VEGF蛋白、ALP蛋白表达情况。本实验中BMSCs传代至4代后，对细胞均行随机分组行进一步检测。经雌激素处理后的细胞BMP-2、VEGF、ALP的表达都比对照组更高（P＜0.05）。说明受到雌激素的刺激作用后，BMP-2、VEGF蛋白和ALP蛋白的表达都出现了显著的提高。见图4～6、表1。

图5 B组VEGF蛋白表达情况

图6 B组ALP蛋白表达情况

表1 BMP-2、VEGF、ALP检测情况（n=5±s）

表1 BMP-2、VEGF、ALP检测情况（n=5±s）

与对照B组比较：*P＜0.05

蛋白对照B组实验B组t值BMP-2（ng）12.21±3.3918.13±1.34*-3.97 VEGF（pg）231.20±9.76311.85±5.04*-16.42 ALP（IU）109.47±3.23143.42±3.55*-15.81

3 讨论

本研究采用的大鼠，体重不超过110～120 g，鼠龄不超过6～8周龄［9］。大鼠重量的把握十分关键。如果重量不够的话，BMSCs数量比较少，反之如果重量太大，干细胞的活性降低，存活率低且实现效果不够明显［10］。培养及传代至4代后，BMSCs的纯度有了显著的提升。由于这种细胞的鉴定难度复杂性较高［11］。本实验主要从形态学上判断，实验主要采取外形鉴定的方法进行判断，细胞形状呈扁平状或长梭形，所有细胞构成旋涡状［9］。取第4代生长良好的BMSCs进行成骨诱导1周。ALP染色结果证明，BMSCs经过成骨诱导后出现ALP表达，进一步表明BMSCs向成骨方向分化。使用雌激素施加一定的刺激作用，在刺激之前，考虑到血清所包含的的物质过于复杂，首先将细胞转移到低糖培养基中进行处理，24 h后停止，在最大程度上消除血清的影响，接着施加雌激素刺激，对细胞进行24 h的作用［8］。运用RT-PCR半定量法和ELISA法检测BMP-2 mRNA、BMP-2、VEGF蛋白和ALP蛋白的表达。检测结果表明，这些物质的表达均有所提高。本研究充分说明雌激素能够通过某种未知的作用促进成骨基因BMP-2以及ALP蛋白的表达，而且对于VEGF的表达具有正向刺激作用，从而加速局部血管的生成。本实验中通过检测显示雌激素作用于细胞后ALP的表达明显上调，而ALP为成骨细胞表达的重要物质之一，进一步从侧面反应了雌激素对细胞成骨作用存在促进作用。

对于骨质疏松症的绝经妇女患者而言，雌激素是一种效果比较理想的治疗方法，其能够抑制患者骨量的降低，避免骨头过脆后经常发生骨折的情况［2］。研究［2］结果表明，BMSCs中存在ER的表达。本研究结果并结合相关文献可以得出，雌激素能够有效促进成骨细胞中BMP-2和VEGF蛋白量的提高，或许是因为其能够和BMSCs中的ER结合在一起而造成的。很多研究［12］早已证明，BMP-2能够使得成骨细胞所包含的VEGF的表达变得更加活跃。研究［4］显示，VEGF能够促进成骨细胞里BMP-2的表达。以上结论似乎显示了这两种物质的作用能够彼此促进。那么在修复骨损伤时，两者或许也能够促进彼此作用的发挥。综上所述，本研究为更加深入地揭示雌激素成骨机制提供新的途径。

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Experimental study of BMP-2 and VEGF's expression in estrogen on bone marrow mesenchymal stem cells

Huang Haifeng，Sun Li，Tian Xiaobin，et al
（Dept of Orthopedics，Guizhou Province People's Hospital，Guiyang 550002）

Objective To study the possible osteogenesis mechanism of estrogen by its effection of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）and vascular endothelial growth factor（VEGF）expression on rat bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）during osteogenic differentiation.Methods The rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated，cultured and proliferated to the fourth generation.After one week osteoblastic induction，the level of osteogenic differentiation was identified by alkaline phosphatase（ALP）staining method.The expressions of BMP-2，VEGF and ALP were measured by the action of estrogen on cells.Results Estrogen could promote the expression of BMP-2 mRNA，BMP-2，VEGF and ALP.Conclusion Estrogen may promote the expression of BMP-2 and VEGF protein through the action of estradiol so as to make the bone formation process more efficient.So this substance can be considered osteoinductively active.

bone marrow mesenchymal stem cells；estrogen；bone morphogenetic protein-2；vascular endothelial growth factor

R 687

A

1000-1492（2016）08-1088-04

时间：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.006.html

2016-04-14 接收

国家自然科学基金地区基金（编号：81560356）；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金（编号：黔科合人字［2011］30号）；贵州省科技计划（编号：黔科合SY字［2015］3044）；贵州省卫生厅科学技术基金（编号：gzwkj2013-1-150）；贵州省人民医院青年基金（编号：GZSYQN［2015］05号）；贵州省卫生计生委科学技术项目（编号：gzwjkj2015-1-018）

贵州省人民医院骨科，贵阳 550002

黄海峰，男，硕士，住院医师；

田晓滨，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：txb6@vip.163.com