高温胁迫下匍匐翦股颖酵母cDNA 文库的构建与鉴定

刘 畅，董康挺，张雅晰，李静思，边秀举，李会彬，王丽宏，孙鑫博

（河北农业大学 农学院/河北省作物生长调控重点实验室，河北 保定 071000)

匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)属禾本科植物，一种冷季型草坪草。由于其修剪品质高、再生能力强、抗逆性较好，是北方地区常用的优质草种［1］，尤其用于建植高质量的精细草坪，如高尔夫球场的果岭和运动场草坪。然而，匍匐翦股颖耐热性较差，在其使用过程中，常常会因为受到高温胁迫而对其生长发育和草坪质量造成严重影响［2］。因此，提高匍匐翦股颖的耐热性是目前亟待解决的问题。挖掘高温响应基因，了解匍匐翦股颖高温响应途径和机理是解决该问题的重要途径。当前，已有部分研究揭示了匍匐翦股颖与高温相关基因的功能［3］，为培育新的抗高温草坪提供了一定的借鉴。然而，植物响应高温胁迫的途径非常复杂，因此，系统地挖掘与高温相关的基因，揭示其整个信号转导的过程是提高匍匐翦股颖抗高温能力的关键所在。

酵母cDNA 文库是挖掘植物相关功能基因的常用方式，而酵母杂交系统则能够利用酵母细胞内DNA 结合结构域（binding domain，BD）和转录激活域（AD）的融合表达功能筛选出目的基因互作蛋白［4］。目前，关于酵母cDNA 文库在各种作物中的研究已逐渐深入［5-9］。随着cDNA 文库的广泛应用，越来越多的未知基因被发现，其功能也被深入的研究［10-12］。但是，关于匍匐翦股颖的cDNA 文库构建信息还未见报道。因此，构建质量好、容量高的匍匐翦股颖cDNA 文库对后续匍匐翦股颖分子机理的研究具有重要意义。通过建立酵母cDNA 文库，能够得到植物基因组的完整信息及克隆片段［13-14］，从而进一步挖掘匍匐翦股颖在高温胁迫下有显著变化的基因，对其进行研究，阐明其功能。此外，通过酵母双杂交技术可以对已知抗热基因的互作蛋白进行筛选与检验，再使用该技术对筛选出的互作蛋白进行一对一验证，揭示抗热基因与其它基因的相互作用，从而阐明匍匐翦股颖抗热信号途径，验证抗热基因功能［15-16］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 将匍匐翦股颖种子均匀的撒播于育苗钵中，待其发芽后移植到直径20 cm 的花盆中进行培养，培养土体积比为泥炭∶蛭石=1∶2，在光照培养箱中进行培养，条件为光23 ℃/16 h，暗23 ℃/ 8 h。

1.1.2 试剂选择 选用载体pDONR222/pGADT7-DEST 为建库载体，所用到的与构建cDNA 文库相关的试剂主要来源于美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen）；转化大肠杆菌的材料来源于TaKaRa（大连宝生物）公司；培养基等在Sigma 公司购买。

1.2 试验方法

1.2.1 试验处理 将培养8 周的匍匐翦股颖植株置于培养箱中进行高温处理，处理条件为光37 ℃/16 h、暗37 ℃/8 h，分别在处理的第0、2、8 和24 h 取叶片，并进行混合，用于后续总RNA 的提取。

1.2.2 Trizol 法提取匍匐翦股颖总RNA 取上述匍匐翦股颖叶片混样材料0.1 g，液氮研碎，用Trizol法提取匍匐翦股颖的总RNA，Oligotex mRNA Midi Kit 试剂盒进行总RNA 的分离纯化，再用1%琼脂糖凝胶电泳对Total RNA 进行质量检测。

1.2.3 初级cDNA 文库的构建 用上述所提取的RNA 作为模板DNA 进行完整cDNA 双链的合成（参照Clone Miner 说明书进行）。在得到cDNA 双链后，用已经合成的完整cDNA 连接于3 种attB1 重组接头。待连接完成后，进行cDNA 的分级分离，收集产物。对收集到的产物进行BP 重组反应，转入大肠杆菌DH10B 进行电击转化。完成后加入SOC 培养基，置于37 ℃，转速为225 ～250 r/min，摇床培养1 小时。培养结束后取培养物10 μL 稀释1 000倍，均匀在LB 培养基上涂50 μL，第2 天计数，用于后续的结果分析，剩余培养物加入甘油至终浓度20%于-80 ℃存好。

1.2.4 构建酵母cDNA 文库 从上述建立的cDNA初级文库中抽取质粒，按照300 ng/μL 的浓度进行稀释。将稀释好的质粒用LR 重组反应法连接到pGADT7-DEST 载体上，将连接好的质粒和载体转入大肠杆菌DH10B 感受态细胞进行培养。取培养物10 μL 稀释1 000 倍，均匀在LB 培养基上涂50 μL，第2 天计数，用于后续的结果分析，剩余培养物加入甘油至终浓度20%于-80 ℃存好。

1.2.5 制备Y187 酵母感受态细胞 取Y187 酵母感受态细胞在YPDA 培养基上划线，30 ℃倒置培养3 ～5 d。挑取生长出来的单菌落于液体YDPA 培养基中震荡，待OD600值到0.5 左右时，离心后倾析上清液，使用ddH2O 将其重悬，再次离心后使用TE/LiAc 溶液将其混合得到Y187 酵母感受态细胞。

1.2.6 cDNA 文库质粒转化 在无菌预冷的15 mL离心管中加入试剂Reaction Component、Herring Testes Carrier DNA、denatured 和次级文库质粒，取50 μL Herring DNA，100 ℃/5 min 冰浴冷却后再重复进行1 次。加入感受态细胞，涡旋振荡混合完全后加入PEG/LiAc 溶液，混合后温育，每隔15 min混合1 次。加入二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）混合完成后，离心去上清，用30 mL NaCl溶液悬浮细胞。将得到的溶液取10 μL 分别稀释10、100、1 000、10 000 倍涂于SD/-Leu 培养基，30 ℃倒置培养3 ～5 d。收集转化子，挑取克隆菌落，进行PCR 鉴定。

2 结果与分析

2.1 匍匐翦股颖Total RNA 检测结果

匍匐翦股颖Total RNA 1%的琼脂糖凝胶电泳检测显示(图1)能够扩增出明亮的条带，且条带的长度大于500 bp，说明Total RNA 质量良好，可作为建库的起始样品。

图1 mRNA 分离结果Fig.1 mRNA separation results

2.2 cDNA 第2 链合成结果

使用1%琼脂糖凝胶电泳检测对合成的双链cDNA 进行检测，结果(图2)显示条带呈弥散状，大小范围在250 ～2 000 bp。表明此cDNA 双链合成质量过关，可使用其进行酵母cDNA 文库的构建。

图2 cDNA 第二链合成结果Fig.2 Results of synthesis of cDNA second strand

2.3 初级文库构建结果鉴定

对初级文库菌液进行稀释、涂布，第2 天观察计数。用“CFU/mL= 平板上的克隆数/50 μL×100×1 000 μL=1 700/50 μL×l00×1 000 μL=3.4×106”的方法计算出库容量的总克隆数CFU=3.4×106×4 =1.36×107个（图3A）。从中随机选取了24 个克隆进行菌落PCR 鉴定，经过1%琼脂糖凝胶电泳的检测发现：初级文库的重组率为100%，插入的克隆片段长度均大于1 000 bp，符合初级文库的建库要求（图3B）。

图3 初级文库库容量鉴定及 cDNA 插入片段重组鉴定结果Fig.3 Identification of primary library capacity and recombination of cDNA insertion fragment

2.4 次级文库构建结果鉴定

将初级文库的菌液取出10 μL，稀释后进行涂布并观察计算克隆数量（图4A），通过观察计算出总克隆数CFU =3.0×106×4=1.2×107个。从中随机选取24 个菌落进行PCR 鉴定，结果显示：该文库的重组率为100%，平均插入片段长度＞1 000 bp（图4B）。经过计算，符合酵母杂交cDNA 文库的要求，可用于后续的匍匐翦股颖酵母杂交相关试验。

图4 次级文库的构建及鉴定结果Fig. 4 Construction and identification of secondary libraries

2.5 cDNA 文库质粒转化Y187 酵母菌株结果

将转化好的菌液涂布在SD/-Leu 培养基上，对其进行观察。发现克隆数目为400 个，工作液的细胞密度>3×107cells/mL，文库滴度(cells/mL) 为4.0×107cells/mL（图5A）。从中选取24 个单菌落进行菌落PCR 鉴定（图5B），扩增出了23 个单菌落条带，由此计算出插入片段平均＞1 000 bp,文库重组率为96%。

图5 cDNA 文库转化 Y187 酵母感受态细胞鉴定结果Fig. 5 Identification of cDNA library transformed into yeast competent cells Y187

3 结论与讨论

在对建立的cDNA 文库进行评价时，主要从2个方面对其进行评价：所建立的cDNA 文库是否有代表性和提取的mRNA 是否完整［17-18］。其中，库容量中包含的独立重组克隆数的多少是决定文库是否有代表性的重要因素。普遍来说，cDNA 文库所包含的克隆数应在1×106CFU 之上才能够说明文库满足后续的使用要求［19］。通过本试验所建立的cDNA文库，经过测定得到克隆数为1.36×107CFU，大于最低克隆数，插入片段平均大于1 000 bp，重组率为100%。说明该cDNA 文库满足mRNA 的筛选要求，可用于后续酵母试验的研究。

通过构建不同作物的cDNA 文库，能够为相关作物研究未知基因及其功能提供基础。通过建立匍匐翦股颖酵母cDNA 文库，能够从中进行挖掘并筛选一批与高温相关的基因［20］。此外，利用酵母cDNA文库还能够有效的筛选目的基因的互作蛋白，通过对蛋白质互作关系的进一步研究，验证与高温相关基因行使何种功能［21］。

采用SMART 技术构建酵母cDNA 文库是得到目的基因较为高效、迅速的方法［22］。本研究详细说明了匍匐翦股颖cDNA 文库的建立方法，通过SMART 技术，建立了可用于酵母杂交试验的高质量匍匐翦股颖酵母cDNA 文库，并将文库质粒成功转入Y187 酵母感受态细胞。为寻找匍匐翦股颖响应高温的基因和后续研究互作蛋白的酵母双杂交试验奠定了基础，也为解释匍匐翦股颖抗高温信号通路提供了重要信息。