芪板青颗粒体外抗PRRSV 效果研究

刘 斌，张 帅，刘濮毓，赵云环，王荣申，范京惠，左玉柱

（1.河北农业大学 动物医学院/河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001；2.石家庄市动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050000）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种烈性传染病。临床症状多表现为不同年龄段猪出血、发热以及呼吸道症状和怀孕母猪流产、死胎、产弱胎等为特征的繁殖障碍，因部分感染猪会出现耳尖、尾尖、乳头、四肢末端或皮肤发绀，故又称“猪蓝耳病”［1-2］。近年来，由于养殖规模的不断增大以及养猪业的迅速发展，PRRS 的发病率日益增加。当前，我国防控PRRS 以接种疫苗为主，但由于PRRSV 的高变异率导致高致病性毒株（HP-PRRSV）、NADC30-like PRRSV 以及重组毒株的出现，使得PRRSV 流行毒株呈现多样性和复杂性，防控PRRS 的难度越来越大，严重影响了中国养猪业的健康发展［3-5］。

中药为纯天然物质，可在不伤害机体的前提下抑制病毒复制，对机体毒副作用小［6］。PRRSV 的主要感染机制是在猪肺泡巨噬细胞上增殖并对肺泡巨噬细胞造成严重破坏，引发猪发热等炎症反应，以及呼吸困难等呼吸道症状，并通过免疫抑制机制诱导其他疫病发生［7］。从中医角度来讲，猪感染PRRSV 是外邪入侵、免疫低下所致，因其外部湿气不断积聚体内，导致肺气不宣，进而阴阳失调，发生该病［8］。因此，中医上以“增免解毒”、“清热燥湿”、“补益肺卫”作为主要对策，做到标本兼治。同时，在减抗替抗的大环境下，中药处方防控PRRS 成为了重要发展方向。黄芪具有益气固表、敛汗固脱、脱毒排脓、扶正祛邪等功效［9］；板蓝根和大青叶具有清热解毒、凉血利咽、抗菌、抗病毒、抗内毒素、增强机体免疫力的功效［10］；蒲公英和金银花具有抗菌抗炎、保肝利胆、增强免疫力等功效［11］；甘草具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、保肝等多重功效［12］。为了有效防治猪繁殖与呼吸综合征，减少PRRS 对养猪业的损失，降低PRRS 发病率，检验以黄芪、板蓝根、金银花、蒲公英、大青叶、甘草为主要成分的芪板青颗粒抗PRRSV 的效果，本试验通过用芪板青颗粒水溶液作用于接种PRRSV的Marc-145 细胞，观察其对PRRSV 的抵抗作用，以期为防治PRRS 提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品与试剂 芪板青颗粒（生产批号：21112204），购自河北征宇制药有限公司，主要成分：黄芪、板蓝根、金银花、蒲公英、大青叶、甘草；胎牛血清（生产批号：12A288），购自上海依科赛生物科技有限公司；DMEM 培养液（生产批号：12100），购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 毒株与细胞株 PRRSV、Marc-145 细胞均由河北农业大学动物医学院预防兽医学实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 芪板青颗粒安全浓度的测定 将Marc-145细胞接种于96 孔细胞培养板中，待其生长成致密单层后，弃上清。用DMEM 维持液将芪板青颗粒进行溶解稀释，再进行2 倍倍比稀释，稀释终浓度分别为100 000.0、50 000.0、25 000.0、12 500.0、6 250.0、3 125.0、1 562.5、781.3、390.6 和195.3 mg/L，共10 个稀释浓度。将各稀释浓度芪板青溶液分别加到已长有单层Marc-145 细胞的培养板中，每孔100 μL，每个稀释度重复6 孔。另以病毒液接种细胞和DMEM 维持液加到细胞中分别作阳性对照和阴性对照，置于37 ℃ CO2恒温细胞培养箱中培养，连续4 d 观察细胞病变情况，根据细胞病变情况确定芪板青颗粒对Marc-145 细胞的毒性，以不出现细胞病变的最大芪板青溶液浓度为最大安全浓度。

1.2.2 PRRSV 标准毒株半数感染量（TCID50）的测定 将Marc-145 细胞接种于96 孔细胞培养板中，待其生长成致密单层后，弃上清。用DMEM 维持液将PRRSV 标准毒株进行10 倍倍比稀释成6 个浓度，将各稀释浓度PRRSV 病毒液加到已长有单层Marc-145 细胞的培养板中，每孔100 μL，每个稀释浓度重复6 孔。另以DMEM 维持液加到已长有单层Marc-145 细胞的培养板作阴性对照，置于37 ℃ CO2恒温细胞培养箱中培养，72 h 后用倒置显微镜观察细胞病变情况，记录病变孔数，根据Reed-Muench 公式，计算PRRSV 的TCID50。

1.2.3 细胞病变判断标准 以“+”表示细胞病变的百分数，即0%～25%为（+），26%～50%为（++），51%～75%为（+++），76%～100%为（++++），阴性对照表示为（-）。

1.2.4 芪板青颗粒在细胞水平上对PRRSV 的抑制作用测定 将Marc-145 细胞接种于96 孔细胞培养板中，待其生长成致密单层后，弃上清。将100×TCID50PRRSV 病毒液接种于已长有单层Marc-145细胞的96 孔培养板中，每孔100 μL，置于37 ℃恒温培养箱中作用2 h 后弃掉上清。将1.2.1 中测定的芪板青溶液从最大安全浓度开始，倍比稀释成10 个浓度，分别加到接种了PRRSV 病毒液的96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，每个稀释浓度重复4 孔。另以病毒液接种细胞和DMEM 维持液加到细胞中分别作阳性对照和阴性对照。置于37 ℃ CO2恒温细胞培养箱中培养，连续4 d 观察细胞病变情况。

1.2.5 芪板青颗粒在细胞水平上对PRRSV 的杀灭作用测定 将Marc-145 细胞接种于96 孔细胞培养板中，待其生长成致密单层后，弃上清。将200×TCID50PRRSV 病毒液与从最大安全浓度开始进行的2 倍倍比稀释成10 个浓度的芪板青溶液等量混合，置37 ℃恒温培养箱中作用2 h 后，加入有单层Marc-145 细胞的96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，重复4 孔。另以病毒液接种细胞和DMEM 维持液加到细胞中分别作阳性对照和阴性对照。置于37 ℃ CO2恒温细胞培养箱中培养，连续4 d 观察细胞病变情况。

1.2.6 芪板青颗粒在细胞水平上对PRRSV 的阻断作用测定 将Marc-145 细胞接种于96 孔细胞培养板中，待其生长成致密单层后，弃上清。将1.2.1 中测定的芪板青溶液从最大安全浓度开始，2 倍倍比稀释成10 个浓度，分别加入有单层Marc-145 细胞的96 孔培养板中，每孔100 μL，置37 ℃恒温培养箱中作用2 h 后弃掉上清。将100×TCID50PRRSV病毒液接种于已吸附芪板青溶液的96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，每个稀释浓度重复4 孔。另以病毒液接种细胞和DMEM 维持液加到细胞中分别作阳性对照和阴性对照。置于37 ℃ CO2恒温细胞培养箱中培养，连续4 d 观察细胞病变情况。

2 结果与分析

2.1 芪板青颗粒安全浓度的测定结果

将10 个稀释浓度的芪板青溶液加到已长有单层Marc-145 细胞的培养板中，经连续4 d 观察后发现，当浓度为100 000.0、50 000.0、25 000.0、12 500.0 和6 250.0 mg/L 时，细胞均出现不同程度的脱落，细胞单层被破坏，随着芪板青溶液浓度逐渐降低，细胞病变逐渐减少，直到浓度为3 125 mg/L 时开始，细胞未出现病变（图1），因此，芪板青溶液最大安全浓度为3 125 mg/L。

图1 不同稀释浓度芪板青溶液下细胞生长情况（200×）Fig.1 Cell growth under different dilution concentration of Qibanqing solution(200×)

2.2 PRRSV 标准毒株半数感染量（TCID50）的测定结果

将经10 倍倍比稀释后的PRRSV 病毒液加到已长有单层Marc-145 细胞的培养板中，经72 h 培养后，用倒置显微镜观察结果如表1 所示，在病毒液稀释度为10-5～10-1时，Marc-145 细胞出现不同程度的病变，随着稀释度增加细胞病变孔数降低，在病毒液稀释度为10-6时，Marc-145 细胞不再出现病变。根据Reed-Muench 公式，计算PRRSV 的TCID50值为10-2.9/0.1 mL。

表1 不同病毒液稀释度细胞病变统计结果Table 1 Statistical analysis of cytopathic changes in different dilution levels of disease venom

2.3 芪板青颗粒在细胞水平上对PRRSV 的抑制作用测定结果

经连续4 d 观察细胞病变情况，记录不同芪板青溶液稀释浓度下产生的细胞病变情况如表2 所示，可以看出芪板青溶液在细胞水平上对PRRSV有抑制作用，在其浓度为3 125.0 和1 562.5 mg/L时，细胞病变百分数均不到25%；随着药物浓度降低，芪板青溶液对PRRSV 的抑制作用逐渐降低，在浓度24.4 ～781.3 mg/L 时，细胞病变百分数为26%～50%；在药物浓度为12.2 和6.1 mg/L 时，虽然细胞病变百分数到了51%～75%，但与只接PRRSV 病毒液的阳性细胞对照相比，仍表现出了抑制作用。

2.4 芪板青颗粒在细胞水平上对PRRSV 的杀灭作用测定结果

经连续4 d 观察细胞病变情况，记录各试验孔与对照孔细胞生长情况如表3 所示，在芪板青溶液浓度195.3 ～3 125.0 mg/L 时，均表现出较强的杀灭作用，细胞病变均低于25%，从芪板青溶液浓度为97.6 mg/L 开始，杀灭作用逐渐降低，但和只接PRRSV 病毒液的阳性细胞对照相比，仍表现出了杀灭作用；同时和2.3 中抑制作用结果相比，杀灭作用优于抑制作用。

表3 芪板青颗粒对PRRSV 的杀灭作用细胞病变统计结果Table 3 Cytopathic statistics of Qibanqing granules against PRRSV

2.5 芪板青颗粒在细胞水平上对PRRSV 的阻断作用测定结果

经连续4 d 观察细胞病变情况，记录各细胞孔结果如表4 所示，芪板青溶液浓度在24.4 ～ 3 125.0 mg/L 范围内对PRRSV 具有阻断作用，在浓度低于12.2 mg/L 时对PRRSV 无阻断作用，整体来看，芪板青溶液对PRRSV 的阻断作用低于抑制作用和杀灭作用。

表4 芪板青颗粒对PRRSV 的阻断作用细胞病变统计Table 4 Cytopathic statistics of the blocking effects of Qibanqing granules on PRRSV

3 讨论与结论

PRRS 是影响养猪行业最严重的疫病之一，由于极高的发病率给全球养殖业造成了巨大的经济损失。PRRS 属外感温热病范畴，临床发病猪主要表现为持续发热、全身发红、耳朵发绀、鼻孔出血、怀孕母猪流产等，中医防治则以“增免解毒”、“清热燥湿”、“补益肺卫”中药为主［13］。因此本试验采用以黄芪、板蓝根、金银花、蒲公英、大青叶、甘草为主要成分的芪板青颗粒复方进行体外抗PRRSV 研究，旨在筛选有效抗PRRSV 中药，为临床应用提供参考依据。

PRRSV 的主要感染机制是侵染猪肺泡巨噬细胞，引起猪发热、炎症反应以及呼吸道症状［7］；同时通过破坏母猪血管内皮细胞导致胎儿无法从母体得到充足的氧气和营养，从而变成木乃伊胎等死胎，存活下的仔猪又通过胎盘感染PRRSV 患病［14-15］；还通过免疫抑制作用致使机体抵抗力下降，诱发其他疾病［16］。黄芪可补气升阳、利水消肿、提高机体免疫力；板蓝根和大青叶可清热解毒、凉血消肿、缓解患病猪呼吸道症状；蒲公英和金银花具有宣散风热、清解血毒、增强抵抗力的功效［17-18］。本试验通过观察细胞病变百分数来测定芪板青颗粒对PRRSV 的抑制、杀灭和阻断作用，发现在芪板青颗粒浓度24.4 ～3 125.0 mg/L 时，对PRRSV 有显著的抑制作用，可将细胞病变抑制到50%以下，芪板青颗粒在24.4 ～3 125.0 mg/L 时，同样能起到杀灭作用，但相对于抑制作用来说，杀灭作用可在195.3 ～3 125.0 mg/L时将PRRSV 杀灭到细胞病变低于25%，因此杀灭作用较强于抑制作用；在芪板青颗粒浓度97.6 ～3 125.0 mg/L 时，可起到显著阻断PRRSV 感染细胞作用，但效果略差于其抑制作用和杀灭作用。虽然对PRRSV 的抑制、杀灭、阻断作用的测定均收到一定效果，但不能完全对PRRSV 抑制、杀灭和阻断，可能由于芪板青颗粒对Marc-145 细胞的毒害作用较大，使得芪板青颗粒对于Marc-145 细胞的最大安全浓度为3 125.0 mg/L。

PRRSV 至今仍是全球养猪生产中最重要的病原体之一，毒株多样化导致患病猪临床表现多变和疫苗保护效力不佳，都给猪场的防治造成极大的困难［19］。本试验测定结果显示：芪板青颗粒对PRRSV 的防控有显著效果，为芪板青颗粒防治PRRS 提供了依据。