细胞培养在生物制药领域的应用

姜萌++季晓宇++罗来鹏++侯毅鞠

【摘 要】经过长时间的研究与实践，细胞培养技术已经得到了充分的发展与完善，离体培养的动物细胞具有可以人为控制的培养条件且结果便于观察的特点，因而被广泛应用于生物制药领域中并对该领域产生了巨大而深远的影响。本文对细胞培养技术在疫苗生产、单克隆抗体制备、药物筛选、基因重组产品等生物制药领域的应用作一综述。

【关键词】细胞培养 生物制药 应用

随着生命科学理论和技术的飞速发展，细胞培养技术的地位和作用日益成熟，动物细胞培养的研究取得了可观的效果，并且有着无限的应用发展前景。主要的发展目标包括：开发生长密度高、目标产品分泌量大的细胞系；研制性能优良、吸附与解离容易、重复利用的微载体；开展规模化的生物反应器、检测系统、细胞培养与产物分离耦合系统等；设计新型培养基促进生物制品安全；研究三维细胞的培养条件[1]。

生物制药即运用生物化学、医学、微生物学等原理和方法，利用生物机体、组织、细胞、体液等生产具有预防、诊断和治疗功能的药物制品。有关研究者采用基因重组技术或其他创新生物技术生产治疗性药物，主要产品有基因工程药物、抗体工程药物、疫苗等几类。这些产品的开发研制及生产过程都离不开细胞培养技术。

1 疫苗生产

疫苗免疫是最有效的预防感染性疾病的措施之一。疫苗免疫是指利用病毒性制剂、细菌性制剂及类毒素等人工主动免疫制剂，通过作用于机体的免疫防御系统起到免疫应答作用。传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但当面临高致病性流感全球大流行、微生物感染、内毒素残余量多等问题时，传统的鸡胚生产方法可能难以满足疫苗市场的需求。随着细胞培养技术的完善及其优点的体现积极推进使用细胞培养技术替代鸡胚培养技术生产流感疫苗，未来将会越来越多依靠细胞培养技术获得理想的疫苗。与此同时也存在一些缺陷，尤其是哺乳动物细胞培养的病毒疫苗特别适合于工业的发展，应用微载体大规模培养细胞生产流感疫苗，使得流感病毒适应传代细胞（如VERO细胞），该细胞不仅培养条件要求不高而且遗传性状稳定，对多种病毒的感染敏感[2]，如利用生物反应器大规模进行病毒繁殖，可实现流感疫苗的规模化生产。MDCK细胞系是被公认为最适于生产甲、乙型流感病毒疫苗的细胞系，对流感病毒增殖快、感染效率高，且不易变异[3]。其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反应器微载体培养Vero细胞生产人用狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗。由此可见，利用细胞培养疫苗已成为目前疫苗研制的重要应用方向。

2 单克隆抗体制备

单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。研究Hb在帕金森病中的发病机制，李旭颖等[4]制备抗Hb单克隆抗体，由重组人Hb作为抗原免疫小鼠，并将其细胞融合及细胞培养制备成杂交瘤，经过筛选获得抗人Hb单克隆抗体杂交瘤株，体内诱生法制备腹水经过酶联免疫吸附试验等方法进而获得特异性抗Hb单克隆抗体。张培等[5]制备乙型脑炎病毒的单克隆抗体通过动物免疫、细胞融合、克隆和筛选等方法，应用ELISA等免疫学方法进行特异性和亚型的鉴定，为快速检测方法的建立奠定了基础。单克隆抗体药物研发已经被列入863计划和国家重点项目，国内已经有2个治疗性单抗产品准备生产，3个治疗性产品处于临床试验阶段，多个抗体药物处于临床研究阶段，已经批准的治疗性单抗有31个，目前国内正在进行临床前研究的抗体药物有：抗CEA嵌合抗体；抗破伤风抗体及抗乙型脑炎等[6]。

3 药物筛选

药物筛选是从天然或合成的化合物中筛选出高效的新药或先导化合物。生物活性和药理作用检测所筛选出的高效的新药或先导化合物，并根据检测结果评价某一物质的药用前景，是新药研究的最初过程和关键步骤。体外二维和应用球状聚集体、细胞片层、脱细胞基质进行三维培养肝细胞的具体技术是进行药物毒性检测的重要途径[7]。Kostadinava等建立了一种长时间的三维肝细胞共培养体系，比单层培养肝细胞能更好地检测体内药物导致的毒性。细胞水平的药物筛选更接近人体生理状态，外界环境干扰少，准确率高，是细胞水平药物筛选模型的核心技术高内涵筛选。高内涵药物筛选主要在微阵列多孔板上完成，通过在微孔板上进行细胞培养，施加药物刺激进行实验操作和数据的采集和分析。HCS技术可完成各种对于细胞生理现象本质的研究，Talyor等[8]提出高内涵概念，HCS模型主要建立在细胞水平，通过观察样品对固定或动态细胞的多个功能的作用，涉及各种不同的靶点，从多个角度分析样品的作用，最终确定样品的活性和可能的毒性。近年来发展起来的微流控芯片技术有可能成为细胞水平药物筛选的理想选择。Ye等[9]构建了一套用于细胞水平药物筛选研究的集成化微流控芯片系统，它可以将细胞种植、培养、标记、加药、梯度稀释等操作通过微通道网络流体控制技术集成到一张芯片完成，保持了细胞结构的完整性，可全面记录细胞对药物刺激的各种反应。

4 基因重组产品

基因工程药物是将人某一部位的基因，注入到质粒中，然后导入工程菌或工程细胞中，经细胞培养或细菌培养，充分表达扩增后，分离，纯化而得。基因重组产品与天然型的生物学活性一致，其结构分为两种，一种与天然型的一样；另一种稍有区别，如人白细胞介素是糖蛋白质，但糖链的有无对其机能无影响，故重组的不含糖链。哺乳动物细胞已成为生物制药最重要的表达或生产系统，FDA（美国食品药品管理局）在2000年以后批准的创新生物技术药物，用酵母表达的有2种，用大肠杆菌表达的产品只有4种，而通过动物细胞培养生产的生物技术产品则有22种，除两种组织工程产品外，其余都是蛋白类产品，这些蛋白都是分子量大、二硫键多、空间结构复杂的糖蛋白，只有使用CHO等哺乳动物细胞表达系统，这些蛋白的生产才成为可能。建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12（rhIL-12）的纯化工艺，赵峰等[10]取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液，分离纯化、定量计算、对纯化产品进行鉴定及检测rhIL-12的生物活性，经检测发现纯化产物回收率和纯度高，适用于工业化生产。

5 前景与展望

细胞培养是模拟机体内的生理环境，使细胞维持生长、繁殖的技术。目前，世界众多领域集中在优化细胞培养环境，改变细胞特性，提高产品的产率并保证其质量和一致性上。细胞培养技术经过不断的研究和完善，已经成为实验室常用的制药研究方法，广泛应用于疫苗生产、单克隆抗体制备、药物筛选、基因重组的生产等领域。

随着现代医药生物技术的发展、人类基因组计划的完成及遗传病基因的不断发现，越来越多的人类功能基因得到克隆、表达和应用。目前基因重组技术、蛋白质工程、抗体工程、细胞工程和基因治疗等新技术的研究取得重大突破与发展，为医药制药技术开拓了一个新领域，并为产生大量有益于人类健康的医药生物技术产品奠定了基础，我们有理由相信细胞培养在生物制药领域会取得更大的突破。

参考文献：

[1]李智.细胞培养核心技术发展近况.科技世界，2014，（15）.

[2]曹大红.病毒类疫苗生产过程中的动物细胞培养及其技术发展.中国科技纵横，2015（21）.

[3]李一峰，谢波，惠觅宙.流感病毒及其疫苗传代细胞制备研究进展.生物学杂志，2012，29（2）：59～64.

[4]李旭颖，李昕，李旭冉，杨巍巍，于兰，王鹏，于顺.抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定.首都医科大学学报，2015，36（5）.

[5]张培，杨柳，于德宪，任瑞文，刘建伟，陈月，唐波恒.几种重要虫媒病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定.广东医学，2014，35（18）.

[6]何敬琦.细胞反应器技术及其在生物制药领域的应用.黑龙江科技信息，2015，（21）.

[7]罗南书，罗南英.体外肝细胞培养及在药物筛选中的应用.中国生物医学工程学报，2015，34（1）.

[8]刘翠，杨书程，李民，刘培庆，陈瓒光，张仁伟.药物筛选新技术及其应用进展.分析测试学报，2015，34（11）：1324-1330.

[9]Ye N，Qin J，Shi W，Liu X，liu B.Lab Chip.2007.7（12）：1696-1704.

[10]赵峰，罗慧娟，叶倩君，张霞，张桂玲，王兴勇，张宜俊.重组人白细胞介素-12（CHO细胞）的纯化及其活性.中国生物制品学杂志，2009，22（11）：1117-1120.