His-prescission蛋白酶基因在大肠杆菌中表达条件的优化

蔡莉，王甫群

（1.江阴职业技术学院环境与材料工程系，江苏江阴214405；2.无锡佰翱得生物科学有限公司，江苏江阴214431）

His-prescssion 蛋白酶是一种带有便于分离纯化的His 标签的蛋白酶，其上的His 标签将会在最后纯化分离中除去，留下的就是PreScission 蛋白酶。PreScission蛋白酶是一种遗传改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C 蛋白酶（HCV3C）和GST 组成[1]。这种蛋白酶是专为蛋白酶的去除而设计，能同时实现蛋白酶的固定和pGEX-6P 载体（pGEX-6P-1、pGEX-6P-2 和 pGEX-6P-3）所产生的GST 融合蛋白的切割[2]。PreScission 蛋白酶能特异切割Glu和Gly残基之间的识别序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，在4℃左右酶活最高，所以酶切在4℃左右时进行，既可以保持目的蛋白的稳定性，又能达到最佳酶切效果。在5℃，50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（pH 7.0）的反应体系中，一个单位酶 16 h 可切割 100 μg 待测 GST 标签蛋白，切割效率在90%以上[3]。

PreScission 蛋白酶作为在蛋白分离纯化过程中应用在亲和纯化时的酶切用酶，在生物医药领域具有很高的应用价值，其应用广泛，具有很高的生物科研价值和经济价值，如上海七海复泰生物科技有限公司生产的PreScission Protease100U 市场售价为750 元，进口的则更加昂贵。随着现代生物科技的不断发展与壮大，Pre⁃Scission 蛋白酶的应用范围与应用价值也会提高，其经济价值不可小觑。

1 材料与方法

1.1菌种

大肠杆菌感受态细胞，BL21(DE3)-T1R，北京天根生化科技有限公司；Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)，上海拜力生物科技有限公司。

1.2 试剂及仪器

核酸蛋白测定仪，赛默飞世尔科技公司；双稳定电泳仪，北京六一仪器厂；干浴微量恒温器、脱色摇床，其林贝尔仪器制造有限公司；紫外分光光度计，上海优尼柯有限公司；双层试管摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；生物洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3质粒的提取及菌种的转化

①含His-prescisssion 基因的质粒的菌种复壮；②含His-prescisssion 基因的质粒的提取；③大肠杆菌菌种的转化。

1.4 His-prescission蛋白酶的表达及流程

（1）His-prescission蛋白酶的表达

本蛋白来源为大肠杆菌，属于初级代谢产物，大肠杆菌与本蛋白酶的生产关系为生产产物偶联型。该目的蛋白在表达过程中，在不加诱导剂前，可少量表达或不表达，加入适量的诱导剂后可大量表达。在37℃诱导表达时，可形成大量包涵体，在分离纯化过程可经复性加工使其恢复生物活性。

（2）His-prescission酶的表达流程（图1）

图1 His-prescission酶的表达流程图

1.5 分析方法

生物量的测定：取1 mL 发酵培养液至比色皿中，用紫外可见分光光度计于600 nm（OD600 nm）处测定吸光值。

发酵液中目的蛋白的测定：取1 mL 发酵培养液至比色皿中，用紫外可见分光光度计于600 nm（OD600 nm）处测定吸光值。根据经验公式：取样量=0.5/吸光值。将取好的样按SDS-PAGE 电泳的操作步骤完成蛋白样的制备及SDS-PAGE 电泳，看聚丙烯酰胺凝胶电泳图，根据目的蛋白条带的颜色深浅和条带的面积大小，判断目的蛋白的表达结果。

2 实验结果

（1）小剂量表达

在本试验中，分别选取BL21（DE3）-TIR、Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)三种感受态细胞作为重组基因His-prescission 的宿主菌，探讨重组基因在这3 种感受态的表达效果。

图2 转化BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)蛋白表达结果

实验结果分析：His-prescission 蛋白酶的条带位置在 17.5 kDa 处，由图 2 转化 BL21(DE3)和 Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)蛋白表达结果可看出，以BL21(DE3)-T1R作为宿主菌，目的蛋白表达量最大，所以感受态BL21(DE3)-T1R 为表达His-prescission 蛋白酶的最佳宿主菌。感受态细胞Rosetta2(DE3)表达His-prescission 蛋白酶的表达量次之。感受态细胞Origami2(DE3)表达Hisprescission蛋白酶最少。

（2）大剂量表达

在9 个3 L 的大摇瓶上写好标签，每个摇瓶内加入600 μL 的 Kana 抗生素，将 20 mL 菌种加到 1 200 mL LB液体培养基内，使用橡皮筋扎紧封口膜，分别放入三个摇床培养，待生物量长至相应的诱导时机时，加入IPTG 诱导培养。培养结束后取200 μL的菌液稀释5倍后在600 nm下测OD值，取样跑SDS-PAGE[4-6]。

图3 正交试验蛋白表达结果

由实验结果分析表1，得出结论：

（1）当培养条件为摇瓶装液量为1 200 mL，接种量为20 mL，培养温度为37℃，摇床转速为130 rpm，诱导时机为1.0时加入IPTG 0.1 mM，诱导培养6 h后，培养基中菌体浓度最高。

（2）当培养条件为摇瓶装液量为1 200 mL，接种量为20 mL，培养温度为37℃，摇床转速为130 rpm，诱导时机为0.7时加入IPTG 0.1 mM，诱导培养6 h后，单位菌体内蛋白表达量最高。

（3）由此可以看到以两种结果分析得到诱导时机不同，所以将上述正交实验的生物量和蛋白表达量作了对比，如图4所示。

图4 正交实验的生物量和蛋白表达量对比

由图3、图4 可见，8 号的生物量和蛋白表达量都很高，8 号的培养条件是：摇瓶装液量为1 200 mL，接种量为20 mL，培养温度为37℃，摇床转速为130 rpm，诱导时机为0.7 时加入IPTG 0.1 mM，诱导表达6 h。故而表达His-prescission 蛋白酶在大肠杆菌中诱导表达的最佳诱导时机为0.7。

表1 正交实验结果分析表

3 总结

本文利用质粒提取试剂盒将含有His-prescission基因的质粒从宿主菌BL21(DE3)中提取出来，再分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)-T1R、Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)，以感受态细胞作为变量，试管装液量、摇床转速、培养温度、接种量、IPTG 加入量作为固定量，通过单因素实验得出大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）-T1R 为最佳宿主菌。然后采用正交实验，进一步探讨His-prescission 蛋白酶在大肠杆菌BL21(DE3)-T1R 中的最佳表达条件。在正交试验中，以摇床转速代替溶氧量，以IPTG 作为诱导剂，选择合适的诱导时机加入适量的诱导剂，诱导培养一段时间后检测其生物量和蛋白表达效果。以大剂量表达的方式，通过正交实验优化His-prescission蛋白酶在大肠杆菌中的最佳表达条件，最佳发酵工艺参数：培养基初始pH 7.0，摇床转速130 rpm，摇瓶装液量1 200 mL，接种量20 mL，培养温度37℃，OD 值达到0.7时，IPTG 0.1 mM/mL，诱导表达时间6 h。