噬菌体纳米抗体展示库构建中电转化条件的优化

李艳宁，李光琪，屈昱良，潘俊斐，楚元奎，张晓春，徐广贤，3

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院儿科，银川 750004；3.广东医科大学医学技术学院医学检验系，东莞 523000）

纳米抗体是存在于骆驼科体内的一种天然缺失轻链的重链抗体（heavy chain variable area，VHH），具有分子量小、特异性高、易通过血脑屏障等众多优势，有广阔的应用前景[1]。目前，纳米抗体制备所采用的关键技术是噬菌体表面展示技术，其原理是通过对目标抗原反复的“吸附—洗脱—扩增”后，使得噬菌体抗体库中能与靶分子特异结合的抗体得到高度富集[2]，一个库容量大及多样性好的噬菌体纳米抗体库是获得特异性抗体的关键所在，特别是针对天然抗体库而言至关重要。而影响抗体库质量的主要因素除了需要特异性好的PCR引物外，高转化效率也是实现构建有效噬菌体抗体库的关键[3]。

目前，电转化法是构建抗体库的最佳途径，也是分子生物学中的常用技术，广泛应用于外源基因的表达、基因克隆及定位等研究[4]。该技术的主要原理是在瞬间强大电压的作用下，溶液中细胞的细胞膜具有了一定的通透性，从而使带电的外源物质以类似电泳的方式进入细胞膜[5]。在不同实验室环境的影响下，感受态细胞的制备以及转化条件都有所不同，故转化效率也存在差异，

因此，应该根据实际情况，对电转化条件进行优化进而探索最佳转化条件，提高转化效率。影响电转化效率的因素颇多，除了细菌的生长状态及外源物质的质量外[6]，电压影响细胞膜的穿透性或外源分子与细胞膜的融合[7]，T4 DNA连接酶也会降低转化效率[8]。此外，电转化结果受到众多因素的综合影响，实际上各个因素不是孤立存在的，而是相互联系、相互作用的。为此，本研究旨在利用Bio-Rad公司的电转化仪，对DNA电转化条件进行优化，得到最大转化效率。据此，建立高质量的天然噬菌体抗体基因库，便于下一步的筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器、试剂与培养基0.2 cm电转化杯、基因电穿孔仪及MyCycler PCR仪（Bio-Rad公司）；Nanodrop 2000、双光束紫外可见分光光度计TU-1901（Thermo公司）；恒温培养箱、台式高速低温离心机（力康公司）。限制性内切酶Not I、Sif I及T4 DNA连接酶（NEB公司）；DNA回收试剂盒（TIANGEN公司）；2×YT培养基、SOC培养基，均按常规配方配制；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌TG1和噬菌体质粒pCANTAB5e（4522 bp，Amp抗性）为本实验室保存，驼源VHH DNA片段为本实验室自行扩增，长约400 bp。

1.2 方法

1.2.1 目的片段与质粒的酶切及连接 采用限制性内切酶Not I、Sif I分别对VHH DNA片段及质粒pCANTAB5e进行酶切，总体系30μL，条件为37℃反应1 h，50℃反应1 h，之后分别采用2%及1%的琼脂糖凝胶电泳验证，用DNA回收试剂盒回收酶切后目的片段，并在10μL连接体系中，噬菌体质粒pCANTAB5e与驼源VHH片段按照摩尔比为3∶1的比例，用1μL的T4 DNA连接酶于4℃进行过夜连接，待测定浓度后保存于-20℃备用，即本文中所述的外源DNA。

1.2.2 T4 DNA连接酶的去除 取出部分连接产物，采用乙醇沉淀法去除T4 DNA连接酶，具体步骤如下：取出连接产物，加入1/10体积3 M的NaAc（pH5.2），2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后在-20℃静置30～60 min。然后4℃，13000×g离心10 min，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀1次，并将产物置于超净工作台中待乙醇充分挥发后，加入适量ddH2O以溶解沉淀并测定浓度后，于-20℃保存。

1.2.3 电感受态细胞的制备 从-80℃冰箱取出大肠杆菌TG1甘油菌，划线接种于2×YT固体平板上于37℃培养10 h，挑取单个菌落接种于3 mL的2×YT液体培养基中，37℃，200 r·min-1振荡培养过夜。次日，按1∶100比例将菌液放大培养于含200 mL的2×YT培养基的锥形瓶中，继续于37℃培养一定时间，后将菌液收集在50 mL离心管中，于冰上静置1 h，9000 r·min-1，4℃离心10 min，弃上清用相同体积提前预冷的去离子水重悬菌体沉淀，离心，重复一次。然后用提前预冷的10%的甘油重悬菌体并离心。用1 mL 10%的甘油（预冷的纯水配制）混悬菌体沉淀，并分装在提前预冷的1 mL EP管中，每管100μL，立即转至-80℃冰箱保存，此即为TG1电感受态细胞。注意：所有步骤在超净工作台中进行。

1.2.4 电转化 从-80℃冰箱中取出大肠杆菌处于不同生长时期时制备的感受态细胞。在冰上融化100μL的TG1感受态细胞，然后按照设定的不同条件，加入一定量的连接产物混匀并静置5 min，接着转入提前预冷的电转化杯中，并设定电转化条件进行电转化，向电击后的细胞中立即添加1 mL预热的SOC培养基并转至1mL离心管中，37℃，220 r·min-1振荡培养1 h，然后取少量菌液倍比稀释后涂布于含氨苄青霉素100μg·mL-1的SOC固体平板上，按照设定的不同培养温度过夜培养，次日计数菌落个数并计算转化效率，其中，转化效率（CFU/μg DNA）=菌落数/DNA量（ng）×稀释倍数×1000，每组实验重复三次，取平均值。

2 结果

2.1 目的片段与质粒的酶切

分别采用1%、2%的琼脂糖凝胶电泳对酶切后的VHH片段及噬菌体质粒pCANTAB5e进行验证并回收目的片段，其中酶切结果见图1。

图1 目的片段与质粒的酶切鉴定图

2.2 细菌生长阶段对转化效率的影响

分别取OD600值为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的TG1菌液制备100μL的感受态细胞，将加入1μg连接产物的感受态细胞在电转化仪预设条件（电容25μF、电阻200Ω、电压2.5 kV）下进行电转化，结果见图2。经分析发现，当细菌处于生长对数期（OD600值为0.4左右）时，达到最高转化效率，随着生长时间的延长，转化效率明显下降，这可能是因为当大肠杆菌处于对数生长期时，菌体的繁殖速度快，生命力旺盛，对电击的损伤修复能力强，所以经电击后的细胞存活率相对较高。

图2 细菌生长状态对转化效率的影响

2.3 电压对转化效率的影响

按照2.2中的实验结果，当TG1菌液的OD600在0.4左右时制备感受态细胞，分别设置电压为1.8、2.1、2.3、2.5 kV，将1μg的连接产物与100μL感受态细胞混合，在25μF电容、200Ω电阻下使用0.2 cm电转化杯进行电转化，当电压在2.3 kV时获得最大转化效率。见图3。

图3 电压对转化效率的影响

2.4 连接产物质量对电转化效率的影响

为了比较不同质量的外源基因对感受态细胞的电转化效率是否存在影响，分别取质量为0.3、0.5、0.7和1.0μg的连接产物电转化至100μL感受态细胞中进行电转，见图4。可见，随着连接产物质量的增加，电转化效率也逐渐提高，当连接产物的质量大于0.7μg时，转化效率并未得到提升。

图4 连接产物质量对电转化效率的影响

2.5 T4 DNA连接酶对转化效率的影响

依据本文2.2～2.4的研究结果，当TG1菌液的OD600在0.4左右时制备感受态细胞，将0.7μg经T4 DNA连接酶去除前的连接产物及T4连接酶去除后的连接产物分别与100μL感受态细胞混合，在2.3 kV电压、25μF电容、200Ω电阻下使用0.2 cm电转化杯进行电转化，结果见图5。可见，经乙醇沉淀法除去T4 DNA连接酶后，相比于T4 DNA连接酶去除前（2.2×107CFU/μg），转化效率提升（7.9×107CFU/μg）。

图5 T4 DNA连接酶去除前后对转化效率的影响

2.6 电转化后培养温度对电转化效率的影响

经电转化并孵育结束后的菌液取适量均匀涂布于含100μg·mL-1Amp的SOC固体平板上，并随机分成两组，一组置于37℃过夜培养，另一组于30℃过夜培养，次日对克隆数进行统计并计算转化效率，发现两组转化效率无差异。见图6。

图6 电转化后培养温度对电转化效率的影响

3 讨论

构建噬菌体纳米抗体库是基于特定抗原筛选相应抗体的一个重要方法，相比于免疫库，天然纳米抗体库避免了免疫动物的繁琐过程，同时理论上可筛选出针对任何抗原的抗体。纳米抗体库的高库容量是筛选抗体的基本保障，然而要成功构建一个容量大的抗体库，首要任务是提高转化效率。可用于转化的方法很多，如氯化钙法、Hanahan法和Inoue法，但这些方法操作复杂，转化效率偏低，且结果重复性差[9]。电转化技术是目前为止最为有效的转化方法，转化效率高，重复性好，结果稳定[10]。该方法几乎适用于所有细胞类型，但不同细胞系有不同的最佳电转条件，不同实验室转化效率也有所区别，因而优化电转条件得到相对稳定的标准化操作方法十分必要。

选用对数生长期的感受态细胞是提高电转化效率的一个重要因素。实验结果表明，当TG1菌处于对数生长早期，即OD600在0.4左右时，达到最高转化效率，随着细菌的老化，转化效率有明显的下降趋势，所以制备电转化用感受态细胞时，应严格掌握菌液的OD600值，以保证较高的转化效率。正如文献[11]所述，处于对数生长期的细菌虽然对电击敏感，死亡率较高，但存活的细菌中其转化子数量较高。当细菌进入对数生长后期，虽然细胞存活率上升，但转化效率逐渐下降，因此电转化的细菌以培养到对数期较为合适。

电压是决定电转化效率的最主要原因。高电压可瞬间击穿细胞膜并形成能让外源物质进入的小孔，由于强电压会对细胞造成极大的损伤，在此过程中一部分细胞会因此受损而死亡使得转化率降低，并且死亡菌体会严重影响细菌的生存空间从而抑制细菌的生长[12]。因此，选择合适的电压是提高转化效率并达到预期效果的关键。本实验中设置电压在1.8~2.5 kV进行电转化，结果发现，当电压为2.3 kV时，电转化效率最好，而电压低于或高于2.3 kV时，转化效率均不同程度降低。

电转化时外源DNA含量对电转化效率也具有很大的影响[13]。本实验中，在100μL感受态细胞中分别加入0.3、0.5、0.7和1.0μg等不同含量的外源基因进行电转化，当其含量在0.7μg时电转化效率最高。此外，在一定范围内，电转化效率与外源DNA的用量呈现正向发展趋势，但当加入的外源DNA的量过多时，转化效率将会下降，说明感受态细胞达到饱和状态。

T4 DNA连接酶在一定程度上也会影响转化效率。研究表明，T4 DNA连接酶以共价作用与DNA结合，同时具有拓扑异构酶的活性，可打开超螺旋DNA的一条链，使其变成单切口环状，然后进行连接修复。较小的质粒容易进入细菌，而超螺旋DNA较单切口环状DNA更易进入细菌，T4 DNA连接酶与DNA结合而形成的大分子复合物以及随后的超螺旋DNA解旋成为单切口环状很可能是T4 DNA连接酶导致电转化效率降低的主要原因[14]，因此，在电转化过程中，应尽量去除T4 DNA连接酶。

电转化技术应用广泛，目前对电转化方面的探索也较多，有研究报道，感受态细胞的浓度、质粒的大小及构象也会影响电转化效率[15]，因此，有必要对电转化条件进行优化。本实验得出的最优条件：在大肠杆菌TG1处于生长对数早期（OD600约为0.4）时制备电感受态细胞，连接产物用乙醇沉淀法去除T4 DNA连接酶后取0.7μg，在电压2.3 kV、电容25μF、电阻200Ω的条件下采用0.2 cm的电击杯对混合后的菌液进行电转化，转化效率都可以保证在107CFU/μg DNA左右，最高可达7.9×107CFU/μg DNA。虽然该转化效率仍然偏低，但基本符合构建噬菌体抗体库的要求。另外，可通过多次电转化从而得到更大的抗体库库容，为后续抗体的筛选奠定良好平台。