人脂肪源性血管外膜细胞对CD34+造血干/祖细胞体外支持的实验研究

周 芮，杨婷婷，张 磊，许 飞，郑 波

（1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏人类干细胞研究所，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院血液内科，银川 750004）

造血干细胞移植是治疗多种难治性血液系统疾病的有效手段，造血干细胞与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）共输注成功促进体内造血重建已有报道[1]。大量研究[2-3]表明，BMSCs不但参与骨髓造血微环境构成，并能在特定条件下分化为造血基质细胞，产生具有多种调节造血作用的细胞因子从而改善造血微环境，促进造血干细胞/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）增殖分化。然而，BMSCs不易获取，难以进行有效分离纯化等问题影响了移植的疗效。因此，寻找替代细胞将是再生医学急需解决的问题。

血管外膜细胞（pericyte/perivascular cells，PCs）被认为是间充质干细胞的前体细胞，是一种沿着人体组织器官的小血管广泛分布，且高表达CD146标记的细胞群[4-5]。研究发现，PCs与BMSCs不仅在组织再生和分化潜能等方面存在相似性[6]，还能够在血管发育和调节微循环稳态方面发挥重要作用[7-8]，Corselli等[9]进一步发现，髓外脂肪组织来源的PCs能够通过细胞间接触激活Notch通路来重构异位造血微环境，从而支持免疫缺陷小鼠HSPCs移植后长期存活。脂肪组织是人体分布最为广泛的组织器官之一，脂肪来源的细胞具有自我更新能力强和高增殖率的特点[10]，并且能够分泌多种支持HSPCs增殖和分化的正性因子[11-12]，如胰岛素样生长因子-1和转化生长因子-β1等，是相关造血细胞的理想来源。但人脂肪源性血管外膜细胞（human adipose-derived pericyte/perivascular cells，hAD-PCs）是否能够体外支持UCB CD34+HSPCs生长国内尚未见报道，本文通过直接接触共培养，探究hAD-PCs对UCB CD34+HSPCs在维持体外生长、造血细胞表面抗原表达及集落形成等方面的潜能，评估hADPCs对UCB CD34+HSPCs的体外支持效力。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

大网膜脂肪标本来源于减重患者胃切除手术术中切除大网膜脂肪组织（n=5），脐血标本来源于宁夏医科大学总医院产科剖宫产手术足月新生儿（n=10），患者及家属签署知情同意书并获得宁夏医科大学总医院伦理学委员会批准。成人骨髓间充质干细胞购自中国赛业生物。

淋巴细胞分离液购自美国GE公司；胎牛血清购自Biological Industries公司；高糖型DMEM培养基购自Gibco公司；红细胞裂解液购自eBioscience公司；丝裂霉素购自Sigma公司；小鼠抗人CD45-APC-H7抗体、小鼠抗人CD34-APC抗体、小鼠抗人CD33-FITC抗体、小鼠抗人CD19-BV 621抗体、小鼠抗人CD10-PE抗体、小鼠抗人CD14-Alexa 700抗体均购自美国BD公司；MACS分选柱购自德国Miltenyi Biotec公司；各规格培养皿和培养板购自Corning美国公司；各规格离心管购自Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同体系基质细胞与UCB CD34+HSPCs直接接触共培养 通过酶解和多参数流式细胞术分选获得hAD-PCs，详见课题组前期建立的分离方法[13]。脐血通过密度梯度离心获取单个核细胞，利用免疫磁珠分选得到UCB CD34+HSPCs。实验组（hAD-PCs组）以hAD-PCs为基质细胞与UCB CD34+HSPCs共培养，阳性对照组（BMSCs组）以BMSCs为基质细胞与UCB CD34+HSPCs共培养，空白组（无基质细胞组）以UCB CD34+HSPCs单独培养。基质细胞以1.5×104/孔细胞密度种植于96孔板，每组设5个复孔，待24 h基质细胞贴壁达80%用4μg·mL-1浓度的丝裂霉素处理2 h。丝裂霉素处理后24 h将UCB CD34+HSPCs以4×104/孔的密度分别加至预先处理hAD-PCs、BMSCs基质层上。

1.2.2 共培养后UCB CD34+HSPCs增殖情况 在共培养的1、2、4周时，倒置显微镜下观察hADPCs组、BMSCs组及无基质细胞组细胞形态和细胞密度的改变。在各时间点收集悬浮的UCB CD34+HSPCs，清洗后细胞加入Tryple消化收集剩余UCB CD34+HSPCs，用台盼蓝拒染法进行细胞计数。

1.2.3 共培养后流式分析UCB CD34+HSPCs造血标记表达情况 在共培养的1、2、4周时，收集悬浮的UCB CD34+HSPCs，离心重悬后以每毫升体积细胞悬液与鼠血清体积比为20∶1进行30 min低温封闭。封闭后将细胞分为样本管、同型管及空白管加入相应的抗体：将总体积60%的细胞设为样本管，加入各抗体（小鼠抗人CD45-APCH7抗体、小鼠抗人CD33-FITC抗体、小鼠抗人CD34-APC抗体、小鼠抗人CD10-PE抗体、小鼠抗人CD19-BV 621抗体及小鼠抗人CD14-Alexa 700抗体）1μL；总体积20%的细胞设为同型管，分别加入1μL小鼠抗人CD45-APC-H7、小鼠抗人CD33-FITC、小鼠抗人CD34-APC、小鼠抗人CD10-PE、小鼠抗人CD19-BV 621及小鼠抗人CD14-Alexa 700的相应抗体；空白管封闭后不加入任何抗体。样本管及同型管加入抗体冰上孵育30 min，重悬后离心清洗残余抗体后重悬至300μL上机检测。因无基质细胞组细胞数持续减少，故不纳入流式检测。

1.2.4 共培养后UCB CD34+HSPCs集落形成情况分析 在共培养的1、2、4周时，收集悬浮的UCB CD34+HSPCs，用台盼蓝拒染法进行细胞计数。以1×103个/mL的细胞数将细胞吹打混匀于甲基纤维素半固体培养基中，将1 mL培养基接种于35 mm×10 mm的培养皿放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养，各培养体系设置3皿。培养2周后倒置显微镜下观察集落形态，大于200个细胞的细胞簇视为一个集落进行计数。因无基质细胞组细胞数持续减少，故不纳入集落统计。

1.2.5 共培养后上清液细胞因子表达水平变化 在共培养体系建立的1、2、4周，将UCB CD34+HSPCs自96孔板中吸出，离心后将细胞上清液留置于1.5 mL无菌EP管中。标注培养体系、培养时间等信息保存至-80℃冰箱，ELISA法检测IL-3、IL-6、TPO、SCF等细胞因子表达水平，因1例数据缺失故取4例共培养的上清液进行细胞因子表达水平统计。因无基质细胞组细胞数持续减少，故不纳入因子分泌检测。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准误（x±Sx）表示。造血标记表达指标、集落单位形成数量和细胞因子表达水平的组间比较采用独立样本t检验，细胞数量三组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同培养体系共培养后UCB CD34+HSPCs形态变化

倒置显微镜下观察结果显示：接种时（0周），hAD-PCs组、BMSCs组及无基质细胞组镜下观察上层细胞UCB CD34+HSPCs折光性良好，分界清晰（图1A～C），hAD-PCs组及BMSCs组镜下可见梭形生长的基质细胞存在（图1A、B）。培养至1周镜下可见hAD-PCs组及BMSCs组细胞密度增长，细胞仍透亮椭圆（图1D、E），而无基质细胞组细胞密度明显降低，形态改变折光性差（图1F）。共培养至2周时，hAD-PCs组及BMSCs组UCB CD34+HSPCs细胞数量明显增长，聚集生长，镜下可见细胞透亮（图1G、H），无基质细胞组细胞形态改变，胞质浑浊，镜下可见密度降低（图1I）。hAD-PCs组及BMSCs组细胞培养至4周时UCB CD34+HSPCs数量降低，细胞仍维持较好的形态（图1J、K），无基质细胞组细胞全部死亡皱缩，丧失细胞正常形态（图1L），与hADPCs组及BMSCs组细胞相比差异明显。

图1 UCB CD34+HSPCs不同培养体系细胞及不同培养时间的镜下表现（×100）

2.2 不同培养体系共培养后UCB CD34+HSPCs细胞数量分析

共培养接种当天（0周）各培养体系UCB CD34+HSPCs初始数量均为4×104个细胞。培养至1周时，hAD-PCs组及BMSCs组的UCB CD34+HSPCs细胞数少量增长，分别增长至（4.83±1.64）×104个细胞和（4.49±1.60）×104个细胞，无基质细胞组细胞大量死亡，细胞数为（1.47±0.27）×104个细胞，各组UCB CD34+HSPCs数量差异均无统计学意义（P＞0.05）。共培养至第2周，hAD-PCs组及BMSCs组UCB CD34+HSPCs细胞数量达到高峰，分别为（5.93±1.45）×104和（5.91±0.79）×104个细胞，无基质细胞组细胞数减少至（0.35±0.10）×104个细胞，hAD-PCs组、BMSCs组共培养后的UCB CD34+HSPCs细胞数量均高于无基质细胞组（P均＜0.05，n=5）。UCB CD34+HSPCs培养4周时，hAD-PCs组及BMSCs组UCB CD34+HSPCs数下降至（4.88±0.97）×104和（3.35±0.63）×104，无基质细胞组无细胞存活。hAD-PCs组及BMSCs组各时间点差异均无统计学意义（P均＞0.05，n=5）。因第5周细胞全部死亡，故未行统计学分析（图2）。

图2 UCB CD34+HSPCs不同培养体系细胞数变化（n=5）

2.3 不同培养体系共培养后UCB CD34+HSPCs造血标记表达情况

经多参数流式细胞术检测BMSCs组和hADPCs组的UCB CD34+HSPCs在1周、2周及4周的全血细胞表达CD45+标记、造血祖细胞表达CD34+CD33-标记、淋巴细胞表达CD10+/CD19+标记和髓系细胞表达CD14+标记（图3A），经统计两组细胞以上表面标记表达在各时间点差异均无统计学意义（P均＞0.05，n=5）（图3B）。

图3 UCB CD34+HSPCs造血标记表达情况分析图

2.4 共培养后UCB CD34+HSPCs集落形成情况分析

共培养1周、2周、4周的UCB CD34+HSPCs细胞种植于甲基纤维素半固体培养基培养14 d均有集落单位形成（图4A），结果显示，在1周、2周和4周UCB CD34+HSPCs形成的集落单位数量两组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05，n=5）（图4B）。

图4 UCB CD34+HSPCs集落形成情况分析图（n=5）

2.5 共培养后上清液细胞因子表达水平分析

采用ELISA法检测BMSCs组和hAD-PCs组共培养上清液中细胞因子分泌水平结果显示，hAD-PCs组的SCF在1周时和G-CSF在2周时表达量高于BMSCs组（P=0.008；P=0.002，n=4）；hAD-PCs组的IL-2在2周时，VEGF、G-CSF和SCF在4周时表达量低于BMSCs组（P=0.01；P=0.04；P=0.02；P=0.004，n=4）；IL-3、IL-6、TPO、IFN-γ及TNF-α表达水平两组各时间点比较差异均无统计学意义（P均＞0.05，n=4）（图5）。

图5 不同培养体系培养上清液中细胞因子表达水平统计图（n=4）

3 讨论

细胞治疗在血液恶性疾病治疗方面已取得了很好的疗效，其中HSPCs移植已成为治疗多种血液系统恶性肿瘤的理想方式[14-16]。BMSCs所组成的骨髓造血微环境是HSPCs赖以生存的基本功能单位，BMSCs分泌的细胞因子及造血细胞本身均参与造血稳态的调控[2]。研究显示，BMSCs在良好培养条件下可通过细胞接触和分泌可溶性因子模拟造血微环境，从而对HSPCs起到体外支持的作用[17-18]。因此，BMSCs被认为是目前促进造血基质细胞理想来源。但是在人体骨髓中105～106个单个核细胞中才能获得1个BMSCs[19]，并且因其缺乏特殊的表面标记难以有效分离纯化，且经过体外培养得到的BMSCs常为混合细胞群，种种问题限制了其应用。为满足临床治疗疾病的需要，分离纯化和扩增出大量的造血基质细胞变得尤为重要。

PCs作为间充质干细胞的前体细胞，可在人体多种组织器官的周围微血管和毛细血管被发现[5，9]。研究发现，髓外脂肪来源的PCs表达趋化因子-12和Notch通路关键配体Jagged-1，移植后可通过细胞间接触和活化Notch信号来维持免疫缺陷小鼠的长期存活[9，20]。Pierantozzi等[21]已证明hAD-PCs与同来源间充质干细胞相比具有更好的分化能力。以上研究结果提示了hAD-PCs在造血方面应用具有广阔的前景，hAD-PCs对于HSPCs是否具有与BMSCs相似的支持作用值得探讨。大量研究表明BMSCs通过细胞接触和分泌细胞因子在造血过程中起着关键作用[22-24]，本研究在未额外添加TPO、SCF等造血促进因子的情况下，将hAD-PCs与UCB CD34+HSPCs直接接触共培养，根据培养后UCB CD34+HSPCs细胞数量、造血细胞标记表达和集落形成能力等指标评估hAD-PCs作为基质细胞对UCB CD34+HSPCs的体外支持效能。

本研究通过检测hAD-PCs和BMSCs作为基质细胞分泌的造血相关细胞因子来比较它们的分泌功能，结果表明hAD-PCs所分泌的部分细胞因子与BMSCs分泌水平存在异同。hAD-PCs组与BMSCs组IL-3、IL-6、TPO、IFN-γ及TNFα表达水平在培养的各时间点差异均无统计学意义。IL-3又被称为多能集落刺激因子，在造血中期促进多能祖细胞向定向祖细胞分化；IL-6则通过抑制树突状细胞的分化参与MSCs的免疫调节[25]，TPO在晚期造血中诱导巨核细胞形成成熟血小板的因子，另外，IFN-γ和TNF-α作为负性造血因子能够与其他因子协同使其停留在细胞周期的静止期，阻断原始细胞进入细胞周期从而抑制造血[26]。hAD-PCs在促进HSPCs增殖分化及动员的细胞因子SCF（1周）和G-CSF（2周）在培养早期分泌量高于BMSCs，IL-2在培养第2周，VEGF、G-CSF和SCF在培养第4周的分泌水平低于BMSCs。研究显示，GM-CSF、SCF、TPO和IL-3等细胞因子可通过快速增加静止期细胞中的活性氧水平从而促进小鼠和人HSPCs的增殖[27]；G-CSF还可刺激体外培养的造血前体细胞形成定向分化的细胞群[28]，白细胞介素家族因子可直接作用于淋巴细胞和促进造血前体细胞分化成熟[25]。但以上细胞因子表达水平的差异宏观表现在促进UCB CD34+HSPCs体外生长、形成集落单位能力和血细胞标记表达方面无统计学意义，表明多数细胞因子需要与其他细胞因子协同共同调节造血功能。其中，UCB CD34+HSPCs增殖结果显示，随着培养时间的延长，hAD-PCs作为基质层培养的UCB CD34+HSPCs细胞数量逐渐增高，在第2周达到高峰后开始下降，细胞增殖趋势与BMSCs组细胞相同；无基质层滋养UCB CD34+HSPCs在培养全程细胞数持续下降，第4周全部死亡。结果表明hAD-PCs作为基质层在培养过程中能够对UCB CD34+HSPCs具有体外支持的能力，进一步证实了Corselli等[9]提出的PCs具有体外维持HSPCs再生能力和自我更新潜能的结论。半固体细胞培养基培养集落形成单位的数量作为评价造血细胞增殖分化能力的重要指标，hAD-PCs滋养的UCB CD34+HSPCs在各时间点表达的全血细胞标记CD45+、造血祖细胞标记CD34+CD33-、淋巴细胞标记CD10+/CD19+和髓系细胞标记CD14+表达与BMSCs组相比差异均无统计学意义，并且以hAD-PCs为基质层和以BMSCs为基质层所培养的UCB CD34+HSPCs经体外培养均能形成集落形成单位，经统计分析集落数量各时间点差异无统计学意义。

综上所述，hAD-PCs作为基质细胞与经典BMSCs相似，具有体外支持UCB CD34+HSPCs的潜能。本课题组后续将进一步探究hAD-PCs与BMSCs调控机制的异同，对于其临床转化作为BMSCs再生医学治疗的替代细胞提供理论依据。