蒙药山沉香抗心肌缺血及其作用机制研究

张冬艳，陆景坤，张 烨，孙 鹏，张 烜，薛培凤

（1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059；2.西安市第三医院药剂科）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌的急性坏死性损伤，在发达国家可能是导致死亡的主要原因[1]。据世界卫生组织（WHO）统计，每年约有1200万人死于MI[2]。缺血性心脏病主要是由冠状动脉循环改变引起的心肌缺血缺氧导致的[3]。当冠状动脉供血或供氧不足，不能满足心肌代谢的需要时，就会造成不可逆的心肌损伤[4]。虽然目前缺血性心脏病主要是以化学药物或机械手段进行控制和治疗，但传统医药具有多成分、多靶点、疗效多样的特点，同样被广泛应用于心血管疾病的临床治疗[5]，并且在该领域显示出广阔的前景[6，7]。

蒙药山沉香是一种蒙医常用药，为木樨科丁香属植物羽叶丁香（Syringa pinnatifolia Hemsl.var.alashanensis Ma.et.S.Q.Zhou）的根、茎和粗枝，又名贺兰山丁香，蒙药名阿拉善-阿嘎如[8]。山沉香有镇赫依、清热、止痛、平喘的功效[9]，主要用于治疗胸闷气短、心肌缺血等心肺疾病，多与其他蒙药配伍使用[10]。现代药理研究主要集中于其抗心肌缺血作用[11-14]，有文献报道山沉香挥发油[11]、醇提物均可改善大鼠（或小鼠）心肌缺血症状[12，13]，山沉香超微粉也可改善大鼠急性心肌缺血各项指标[14]。

本研究分别给予Wistar大鼠山沉香原粉、醇提物、挥发油、醇提物+挥发油，并采用ISO诱导急性心肌缺血的模型，初步评价山沉香对心肌缺血的治疗作用、活性部位及其可能的作用机制，为该蒙药作为抗心肌缺血药物应用于临床提供理论基础和实验支持。

1 实验材料

1.1 实验药材

山沉香药材购自呼和浩特药材总公司，经鉴定为羽叶丁香（Syringa pinnatifolia Hemsl.var.alashanensis Ma.et.S.Q.Zhou）去皮的茎和枝干。

1.2 实验试药

异丙肾上腺素（上海迈瑞尔化学技术有限公司），苏木精、伊红（西力生物），总RNA提取试剂盒（泽生试剂耗材），Trizol试剂盒（TaKaRa公司），反转录试剂盒（TaKaRa公司）。

1.3 实验动物

健康Wistar雄性大鼠，体重（200±20）g，（动物许可证号SCXK（京）2006-0009，北京维通利华公司）。

1.4 仪器

BL-420F生物机能实验系统多道生理记录仪（成都泰盟软件有限公司），FA1104电子分析天平（上海海康电子仪器厂），包埋机、石蜡切片机、摊片机、烘片机（德国Leica公司），光学显微镜（德国Leica公司，连接LAS V4.5图像分析软件），PCR仪（美国Applied Biosystems公司），台式低温离心机（德国EPPENDORF公司），恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂），电泳设备（美国BIO-RAD），凝胶成像系统（champGel 5000）。

2 方法

2.1 药材制备

600g山沉香原药材经粉碎机粉碎后，过80目筛，得山沉香原粉，等量分成3份，各200g。200g干燥山沉香药材粗粉加入6倍量95%乙醇，加热回流提取3次，每次2h，然后合并滤液，60℃水浴挥发至无醇味，将所得浸膏真空干燥至完全干燥，研磨成粉末后过80目筛，得山沉香醇提物粉37.04g。200g干燥山沉香药材粗粉加入蒸馏水至没过药材，用挥发油提取器提取，得山沉香挥发油0.62g。

2.2 实验分组及处理

65只大鼠随机分为7组：空白对照组（10只），模型组（10只），阳性对照组（普萘洛尔10mg.kg-1，9只），山沉香原粉组（1.62g.kg-1，9只），山沉香醇提物组（0.3g.kg-1，9只），山沉香挥发油组（5.5mg.kg-1，9只），山沉香醇提物+挥发油组（剂量按1：1配比，9只），空白对照组和模型组灌胃同等体积的0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），山沉香原粉、醇提物及挥发油剂量按同等质量原粉中提取醇提物和挥发油克数折算所得。各组每日灌胃一次，连续灌胃9天。

2.3 造模方法

皮下注射ISO（85mg.kg-1）造成大鼠急性心肌缺血的模型[15]，除空白对照组外，其余各组均在第8天和第9天灌胃1h后，腹部皮下注射ISO（85mg.kg-1）。

2.4 心电图监测

大鼠用5%水合氯醛麻醉后仰卧固定，用针电极钳夹住四肢，采用标准肢体Ⅱ导联连续进行心电监测。末次注射ISO（85mg.kg-1）后，实时监测大鼠体表肢导联心电图，持续动态观察大鼠心电图的变化，每只大鼠采集15min，采集图像后观察并比较各组心电图变化差异。

2.5 心脏病理组织检测

取各组大鼠心脏，生理盐水冲洗至无血色，在10%福尔马林液中固定48h以上后，采用HE染色法观察心肌组织的病理变化情况。

2.6 心脏组织中Bax、Bcl-2的表达

将心脏组织在研钵中磨碎，每50～100mg组织加1ml裂解液，按照Trizol试剂盒和总RNA提取试剂盒的操作方法，提取各组大鼠心肌组织总RNA，设计引物后，利用反转录试剂盒逆转录合成cDNA，最后进行PCR扩增。

选用GAPDH作为内参基因，引物序列分别为：GAPDH上游引物序列5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3'，下游引物序列5'-CACAAACATGGGGGCATCAGCGG-3；Bax上游引物序列5'-CCAGGACGCATCCACCAAGAA-3'，下游引物序列5'-AGTGTCCAGCCCATGATGGTTC-3'；Bcl-2上游引物序列5'-CCCCTGGCATCTTCTCCTTC-3'，下游引物序列5'-CCTGAAGAGTTCCTCCACCACC-3'。

反转录反应温度条件为37℃15min，85℃5s，温度降至4℃后取出，其产物cDNA于-20℃保存备用。PCR反应温度条件为94℃5min初变性，然后94℃30s，56℃30s，72℃30s，72℃延伸7min，共完成35个循环。对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，紫外条件下，采集凝胶图像，Image J软件对图像进行灰度值分析。

2.7 统计方法

各组大鼠心电图监测结果采用SPSS20.0软件进行分析，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。采用SPSS 20.0软件对各组大鼠Bcl-2/Bax灰度值比值进行分析，采用t检验，检验水准为α＝0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 山沉香对大鼠急性心肌缺血心电图的影响

实验结果见表1。各组大鼠典型心电图见图1。与空白对照组比较，其他各组S-T段均有所抬高。模型组大鼠心电图表现出明显波形改变，S-T段异常抬高；各给药组与模型组比较，急性心肌缺血心电图表现均有所改善。以心电异常率为指标，结果显示：醇提物组与模型组相比，心电异常率经卡方检验，χ2=2.686，P=0.005（P＜0.01）；醇提物+挥发油组、挥发油组心电异常率均为66.67%，两组与模型组相比，χ2=0.465，P=0.303（P＞0.05）；原粉组与模型组相比，χ2=2.686，P=0.057（P＞0.05）。统计结果表明：与其他给药组相比，山沉香醇提物对大鼠急性心肌缺血时S-T段的抬高具有更为明显的治疗作用，且与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），说明山沉香醇提物对ISO所致的大鼠急性心肌缺血治疗作用最显著。

图1 各组大鼠典型心电图Fig1 Typical ECGs in each group

表1 山沉香对大鼠急性心肌缺血心电图的影响Tab.1 The effect of Syringa pinnatifolia on ECG of acute myocardial ischemia in rats

3.2 山沉香对急性心肌缺血大鼠心肌组织病理变化的影响

在400倍光学显微镜下观察心肌组织HE染色切片，结果见图2。由图可见，空白对照组大鼠心肌细胞完整，排列整齐规则，横纹及肌小节清晰可见。心肌细胞着色均匀，细胞核形态正常、无固缩，核内染色质分布均匀，细胞膜完整，细胞界限清晰（见图2A）。模型组大鼠心脏组织心肌纤维损伤呈弥漫大片状（见图2B）。阳性对照组（普萘洛尔组）心肌细胞排列整齐规则，横纹清晰。少有炎细胞浸润，着色略不均匀，心肌纤维间隙稍大（见图2C）。山沉香挥发油组大鼠心肌纤维间隙增大，部分区域着色不均匀，间质血管内有轻度出血（见图2D）。醇提物组心肌缺血改善明显，心肌细胞排列整齐规则，结构完整，横纹清晰可辨（见图2E）。原粉组病变较轻，胞质轻度水肿、深染，心肌纤维间隙较大（见图2F）。醇提物+挥发油组大部分心肌细胞完整、无异常，着色轻度不均匀，心肌纤维间隙较大，少部分溶解断裂（见图2G）。

图2 各组大鼠心肌组织典型病理变化（400×）Fig2 The typical pathological changes of myocardial tissue in each group（400×）

3.3 山沉香对缺血心脏组织中Bax、Bcl-2的表达变化的影响

实验结果见图3。阴性组仅加入辅助试剂，未加入各组大鼠心脏组织PCR产物或引物试剂，作为阴性对照。由图可见，除阴性组外所有样本中GAPDH均有表达，模型组Bcl-2表达较弱，醇提物组、醇提物+挥发油组Bax表达较弱。

图3 Bax、Bcl-2及GAPDH的凝胶图像Fig3 The gel images of Bax,Bcl-2 and GAPDH

对采集的凝胶图像，采用Image J软件对图像进行灰度值分析后，计算Bcl-2/Bax比值。由图4可见，除挥发油组外，山沉香其他各处理组Bcl-2/Bax比值显著高于模型组（P＜0.05），其中醇提物组Bcl-2/Bax比值显著高于其他组（P＜0.001）。

图4 各组大鼠Bcl-2/Bax值比较Fig4 Comparison of Bcl-2/Bax values in each group

4 讨论与结论

ISO是一种β肾上腺素受体激动剂，当大剂量的ISO注射到动物体内时，会引起类似于人类心肌缺血的症状，可导致心肌细胞能量耗竭和不可逆的细胞损伤。因此，利用ISO建立MI模型已被各种药物研究所采用[16]，其剂量参照文献选择[15]。

心电图的相关表现是诊断MI的重要标准。ST段抬高或压低区别缺血或非缺血。在本研究中，我们发现了ISO组的大鼠心电图ST段明显升高，这可能与心肌缺血或坏死等因素有关[16]。山沉香各处理组成功地改善了ISO诱导的心电图异常，说明山沉香对心肌缺血损伤具有保护作用。

HE染色是评估心肌损伤的重要方法[17]。组织病理学检查进一步证实了心电图监测的结果。我们发现心肌梗死的主要病理表现为损伤区域心肌纤维间隙增大，排列紊乱、扭曲，溶解断裂，水肿明显，横纹不清甚至消失，间质血管内充血、出血，淋巴细胞浸润等。山沉香各处理组治疗后上述病理表现明显改善。以上结果表明，山沉香能有效改善ISO诱导的心肌梗死。

大剂量的ISO也会导致活性氧的产生和抗氧化酶系统的丧失。氧化应激通过直接或间接的机制介导心肌细胞凋亡，导致心肌梗死[16]。Bcl-2蛋白家族被认为是调节细胞凋亡的关键因素。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白（Bax）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）[18]。本研究发现，山沉香各处理组Bcl-2/Bax比值显著高于ISO模型组（P＜0.05），其中醇提物组Bcl-2/Bax比值显著高于其他组（P＜0.001）。

本研究采用不同的方式对山沉香药材进行处理，得到山沉香原粉、醇提物及挥发油，比较了各组对大鼠急性心肌缺血的治疗作用，结果发现醇提物的作用最显著，表明醇提物可能是山沉香治疗心肌缺血的主要活性部位。但要具体到更小的活性部位或某些活性成分，还需要利用化学手段进一步去除无效或有害成分，结合更加广泛的体内及体外试验，才能逐渐明确。另外，实验结果表明山沉香可能是通过上调抗凋亡因子（Bcl-2）和下调促凋亡蛋白（Bax）来保护心肌细胞，抑制细胞凋亡。考虑到传统医药多成分、多靶点的特点，山沉香也有可能通过其他炎症或凋亡途径发挥抗心肌缺血作用。因此，未来需要更多更深入的研究，才能更加明确山沉香抗心肌缺血的药效物质基础，完善其作用机制。