布托啡诺通过调控miR-665表达对脂多糖致心肌细胞炎症反应及细胞凋亡的影响

魏利娟，马亚飞，陈小莉，郭仲辉，王鹏华

心肌细胞损伤是引起心血管疾病的重要原因之一，其中，炎症反应引起的心肌细胞凋亡是诱发心肌细胞损伤的重要因素，脂多糖(LPS)属于革兰阴性菌胞壁的重要成分，LPS可促进炎症反应从而加重心肌细胞损伤，因此，如何减轻心肌细胞损伤成为治疗心血管疾病的关键[1]。右美托咪定可抑制高迁移率族蛋白B1(HMGB1)介导的炎症反应，保护心肌细胞免受缺氧/复氧损伤[2-3]。但相关麻醉药物对心肌细胞损伤的作用机制尚未完全阐明。布托啡诺是人工合成的一种阿片受体激动剂，其可激活心肌阿片受体从而保护心肌细胞。研究表明，布托啡诺通过抑制线粒体介导的细胞凋亡而减轻心肌缺血再灌注损伤[4]。微小RNA(miRNA)在LPS诱导的心肌细胞中可发挥重要调控作用。研究发现，黄芪多糖通过调节miR-127表达而减轻LPS诱导的心肌细胞炎症损伤[5]。但布托啡诺是否可通过调控某些miRNA表达从而发挥作用尚未阐明。微小RNA-665(miR-665)在心肌缺血再灌注损伤中表达水平升高，敲低其表达可激活p21激活激酶-1(PAK1)/蛋白激酶B(Akt)信号通路，从而减轻心肌细胞损伤[6]。但布托啡诺是否通过调控miR-665的表达影响LPS致心肌细胞炎症反应和细胞凋亡尚未可知。因此，本研究采用LPS诱导心肌细胞建立细胞损伤模型，探讨布托啡诺是否可通过调控miR-665的表达从而参与LPS诱导的心肌细胞炎症反应及凋亡过程，并探究其可能作用机制，为进一步阐明布托啡诺治疗心血管疾病的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 布托啡诺购自江苏恒瑞医药股份有限公司；大鼠心肌细胞H9C2购自上海钰博生物科技有限公司；LPS购自上海沪鼎生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol试剂、反转录与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双染法细胞凋亡检测试剂盒购自上海瑞楚生物科技有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-665、miR-NC、miR-665 mimics购自广州锐博生物技术有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 心肌细胞接种于96孔板(5×103个/孔)上，分别加入浓度为10 mg/L LPS的培养液培养24 h[7]，设为LPS组。同时将正常培养的细胞作为Con组。使用不同浓度(1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L)的布托啡诺与含有浓度为10 mg/L LPS的培养液培养24 h[8]，分别设为LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组。参照Lipofectamine2000试剂说明书分别将anti-miR-NC、anti-miR-665转染至心肌细胞，加入含有浓度为10 mg/L LPS的培养液培养24 h，分别设为LPS+anti-miR-NC组、LPS+anti-miR-665组。参照Lipofectamine2000试剂说明书分别将miR-NC、miR-665 mimics转染至心肌细胞，加入含有4 μmol/L布托啡诺与10 mg/L LPS的培养液培养24 h，分别设为LPS+Bu+miR-NC组、LPS+Bu+miR-665组。

1.2.2 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测TNF-α、IL-6水平 取各组心肌细胞培养液，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组心肌细胞加入预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，弃上清，加入500 μL结合缓冲液重悬细胞后依次加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μL)与PI(5 μL)，室温振荡孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR检测细胞中miR-665的表达水平 Trizol法提取各组心肌细胞中总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA(严格按照试剂盒说明书进行操作)，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应(严格按照试剂盒说明书进行操作)，反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循环。应用美国ABI ViiA7 qRT-PCR仪检测miR-665相对表达量。

1.2.5 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测Bcl-2、Bax蛋白表达 取各组心肌细胞加入400 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度，蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)反应，转膜、封闭，分别孵育一抗稀释液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h后分别孵育二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h后进行曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结 果

2.1 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞炎性因子表达的影响 与Con组比较，LPS组TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组TNF-α、IL-6水平依次降低(P<0.05)，且LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组TNF-α、IL-6水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞炎性 因子表达的影响(±s，n=9) 单位：pg/mL

2.2 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 与Con组比较，LPS组细胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组细胞凋亡率依次降低(P<0.05)，Bax蛋白水平依次降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平依次升高(P<0.05)，且LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组细胞凋亡率、Bax蛋白、Bcl-2蛋白水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表2。

表2 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 (±s，n=9)

图1 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

2.3 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞中miR-665表达的影响 与Con组比较，LPS组miR-665表达水平升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组miR-665表达水平依次降低(P<0.05)，且LPS+Bu-L组、LPS+Bu-M组、LPS+Bu-H组miR-665表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞中miR-665表达的影响 (±s，n=9)

2.4 抑制miR-665表达对LPS诱导的心肌细胞炎性因子表达和细胞凋亡的影响 与LPS+anti-miR-NC组比较，LPS+anti-miR-665组TNF-α、IL-6水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图2、表4。

图2 抑制miR-665表达对LPS诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响(A为凋亡相关蛋白表达；B为细胞凋亡流式图)

表4 抑制miR-665表达对LPS诱导的心肌细胞炎性因子表达和细胞凋亡的影响(±s，n=9)

2.5 miR-665过表达逆转了布托啡诺(4 μmol/L)对LPS诱导的心肌细胞炎性因子表达和细胞凋亡的作用 与LPS+Bu+miR-NC组比较，LPS+Bu+miR-665组TNF-α、IL-6水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平均升高，Bcl-2蛋白水平降低，差异均有统计学意义(P<0.001)。详见图3、表5。

图3 miR-665过表达逆转了布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的作用(A为凋亡相关蛋白表达；B为细胞凋亡流式图)

表5 miR-665过表达逆转了布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞炎性因子表达和细胞凋亡的作用(±s，n=9)

3 讨 论

有研究表明，丙泊酚通过靶向miR-181a/ Bcl-2减少蒽环类药物诱导的心肌细胞凋亡[9]。丙泊酚通过调控miR-451/HMGB1分子轴而减轻心肌缺血/再灌注损伤[10]。丙泊酚可减轻心肌细胞氧化应激损伤[11]。表明麻醉药物具有抗心肌细胞损伤的作用，但其具体作用机制尚未阐明。

布托啡诺通过靶向核因子-κB(NF-κB)减轻化脓性大鼠脑损伤[12]。布托啡诺对缺血再灌注损伤心肌具有保护作用，可降低缺血再灌注损伤心肌炎性因子的释放，其作用可能与布托啡诺激活κ受体有关[13]。布托啡诺可减轻脓毒症大鼠心肌细胞损伤[14]。本研究结果显示，LPS处理后可明显提高TNF-α、IL-6水平，与相关文献报道结果[15]相似，提示心肌细胞损伤模型建立成功。进一步分析显示，不同剂量的布托啡诺处理后可明显降低TNF-α、IL-6水平，且随着药物剂量的增加而明显降低，提示布托啡诺可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症反应，且呈剂量依赖性。心肌细胞中促炎因子大量释放可促进Bax表达，Bcl-2属于抗细胞凋亡家族成员，而Bax属于促细胞凋亡家族成员，其可激活线粒体途径从而诱导细胞凋亡[16]。本研究结果显示，LPS诱导的心肌细胞凋亡率升高，Bax表达升高而Bcl-2蛋白表达降低，不同剂量的布托啡诺处理后可明显降低LPS诱导的心肌细胞凋亡率，抑制Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达，提示布托啡诺可抑制LPS诱导的心肌细胞炎症反应及凋亡从而减轻细胞损伤，且呈剂量依赖性。

本研究结果显示，LPS可提高心肌细胞中miR-665表达水平，而不同剂量的布托啡诺处理后可明显降低miR-665表达水平，且随着药物剂量的增加而明显降低，提示布托啡诺可能通过下调miR-665表达从而减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。有研究表明，miR-665上调表达通过抑制内质网应激而促进炎症性肠病细胞凋亡及结肠炎[17]。miR-665通过抑制CD34介导的冠状微血管的血管新生而加重心力衰竭[18]。右美托咪定通过调控miR-665表达而对心肌细胞氧化应激损伤发挥保护作用[19]。本研究结果显示，抑制miR-665表达可明显降低LPS诱导的心肌细胞TNF-α、IL-6水平及细胞凋亡率。进一步研究显示，miR-665过表达可明显逆转布托啡诺对LPS诱导的心肌细胞炎性因子表达和细胞凋亡的作用。提示布托啡诺通过下调miR-665的表达从而减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。

综上所述，布托啡诺可通过下调miR-665的表达抑制LPS诱导的心肌细胞炎症反应及细胞凋亡从而减轻心肌细胞损伤，其可能作为布托啡诺治疗心血管疾病的作用靶点。