复方七芍降压片通过调控MMP-2/TIMP-2对冠心病大鼠血管重塑及动态血压的影响

宣学习，张 宇，张 华，张传西，袁义强

冠心病是一种常见的心血管疾病，其降压治疗复杂，无论血压是否达到高血压标准[>140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]，均需应用降压药，且需避免血压过低[1]。另外，冠心病可导致机体出现血流动力学改变，引发血管重塑，增加心、肾、脑等重要脏器损害发生风险，且与血压变化密切相关，使得降压药物选择难度大[2-3]。因此，选择恰当降压药物，缓解或逆转冠心病病人血管重塑，维持血压稳定，对减少重要脏器损伤具有重要意义。复方七芍降压片为高血压治疗经验方，可化瘀息风、养阴柔肝。有学者提出，复方七芍降压片不仅能控制血压，还可改善主动脉血管重塑，但作用机制尚不明确[4]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)为锌依赖性蛋白水解酶家族的一类，其中MMP-2在心脏及主动脉重塑中发挥重要作用，是评价血管重塑的生物标志物之一[5]。基质金属蛋白酶组织抑制物-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2)可结合MMP-2，增加主动脉、脑血管内胶原蛋白堆积，诱发重塑[6]。既往报道指出，MMP-2/TIMP-2信号通路激活，可能是引发血管重塑的一个关键因素[7]。本研究旨在观察复方七芍降压片对冠心病大鼠血管重塑、动态血压的影响并分析其作用机制，为冠心病康复治疗提供理论依据及方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60只清洁级健康雄性SD大鼠，购自北京科兴生物制品有限公司，许可证号：SYXK(京)2019-0053，7周龄，体质量(300±20)g。给予大鼠标准饲料、自由饮水喂养，12 h/12 h昼夜周期照明，环境温度(22±2)℃，湿度55%。本研究经动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物、试剂和仪器 复方七芍降压片[湖南中医药大学第一附属医院药剂科(压片前状态)，批号：160416]，卡托普利片(中美上海施贵宝制药有限公司，批号：1712108)，戊巴比妥钠(天津市凯通化学试剂有限公司，批号：181208)。白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(北京东亚生物技术研究所)，兔抗大鼠MMP-2、TIMP-2一抗及山羊抗兔二抗IgG(美国Cell Signaling Technology公司)，丙二醛(malonaldehyde，MDA)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。BP-2010A小动物无创血压仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，5417R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，AU-5421型全自动生化仪(美国Beckman Coulter公司)，IX71型倒置显微镜及照相装置(日本Olympus公司)，GelDoc 2000凝胶成像系统(美国BioRAD公司)，Multiskan型酶标仪(美国赛默飞世尔公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 大鼠均适应性喂养1周，随机取10只作为空白对照组(A组)，另外50只参照文献[8]采用冠状动脉结扎法建立冠心病大鼠模型。大鼠以2%戊巴比妥钠50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，固定在手术台上，气管插管，连接人工动物呼吸机进行呼吸支持。于胸骨左侧第3肋、第4肋间正中线作5 mm纵形切口，在心脏左心耳根旁下2～3 mm处穿线，冠状动脉左前降支结扎，建立心肌缺血模型。完成结扎后，快速还纳心脏，关闭胸腔，恢复自主呼吸。建模成功标准为术后Ⅱ导联心电图ST段弓背向上抬高。50只大鼠建模成功44只，成功率88.00%。将44只大鼠随机分为模型组(B组)、卡托普利组(C组)、复方七芍降压片低剂量组(D组)、复方七芍降压片高剂量组(E组)，各11只。A组不结扎冠状动脉左前降支，其余步骤同上，10只大鼠均未死亡，纳入研究。

1.2.2 干预方法 建模成功1周后开始灌胃，按照《药理实验方法学》[9]中成人(70 kg)与大鼠(200 g)间体表面积换算公式给药。复方七芍降压片(压片前)灌胃前用蒸馏水配制成浓度为2 mL混悬液，成人每日用量49 g，D组以成人等效量灌胃，即4.41 g/(kg·d)，给药量10 mL/kg，每日1次，连续4周；E组以成人等效量2.0倍灌胃，即8.82 g/(kg·d)，给药量10 mL/kg，每日1次，连续4周。卡托普利灌胃前用蒸馏水配制成浓度为2 mL混悬液，成人每日用量75 mg，以成人等效量灌胃，即6.75 mg/(kg·d)，给药量10 mL/kg，每日1次，连续4周。A组、B组以2 mL蒸馏水灌胃，给药量为10 mL/kg，每日1次，连续4周。期间各组大鼠每周测量1次血压。

1.2.3 无创血压仪检测动态血压 分别在治疗1周、2周、3周、4周时，采用尾动脉测压法检测各组大鼠动态血压。经尾袖法连接小动物无创血压仪，检测尾动脉舒张压、收缩压，各测3次，取平均值。测压时间段加温，以大鼠尾动脉有搏动信号为佳，并注意动作轻柔，避免激惹大鼠，影响血压测量。

1.2.4 样本取材、处理 末次给药并检测动态血压后，以2%戊巴比妥钠50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，手术台上固定。颈动脉放血处死，快速取出胸主动脉，分为4份。其中3份置于液氮保存，以备检测炎症指标、氧化应激指标及MMP-2、TIMP-2蛋白表达；1份置于4%多聚甲醛固定，以备检测血管重塑参数。

1.2.5 ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取液氮保存的胸主动脉组织，经生理盐水，冰浴下制备10%组织匀浆。4 ℃、10 000 r/min离心，离心半径8 cm，共10 min，取上清液。采用ELISA法检测IL-lβ、IL-6、TNF-α水平，严格按照试剂盒使用说明书进行操作。将不同程度标准品100 μL、标本100 μL加入相应反应孔，混匀，37 ℃温育2 h。板内液体甩干，洗涤4～6次，滤纸上印干；以100 μL一抗工作液加入各孔，混匀，37 ℃温育，共1 h，甩干，洗涤4～6次，滤纸上印干；以100 μL酶标工作液加入各孔，混匀，37 ℃温育，共30 min，甩干，洗涤4～6次，滤纸上印干；以100 μL底物工作液加入各孔，混匀，37 ℃温育，共15 min；各孔加入100 μL终止液，混匀，反应10 min，观察酶标仪450 nm处吸光值。以吸光值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，创建标准曲线，按照标本吸光值获得浓度。

1.2.6 ELISA法检测ROS、MDA水平 取液氮保存的胸主动脉组织，经生理盐水，冰浴下制备10%组织匀浆。4 ℃、10 000 r/min离心，离心半径8 cm，共10 min，取上清液。以纯化的大鼠ROS抗体包被微孔板，制成固相抗体，包被一抗的微孔内依次加入ROS，37 ℃温育2 h。完成温育后，抗ROS抗体结合链霉亲和素-HRP，形成免疫复合物，温育，洗涤，加入底物工作液，观察颜色变化，颜色深浅与样本中ROS浓度呈正相关。酶标孔加入50 μL终止液，反应10 min，随后酶标仪空白孔调零，于酶标仪450 nm波长处，对各孔吸光值进行测量。以吸光值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，创建标准曲线，按照标本吸光值获得浓度。同样方法检测MDA水平。

1.2.7 HE染色法观察血管重塑参数 取4%多聚甲醛固定的胸主动脉组织，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片，厚度4 μm。进行HE染色，中性树胶封片，图像分析应用Image-Pro Plus 6.0系统软件。显微镜下(×400)观察胸主动脉组织形态学变化，拍摄照片。检测并记录血管重塑参数，包括中膜厚度(media thickness，MT)、管腔内径(lumen diameter，LD)，分别自顺时针方向连续检测12个值，取平均值；计算MT/LD。

1.2.8 蛋白质印迹法(Western Blot)检测MMP-2、TIMP-2蛋白相对表达量 取液氮保存的胸主动脉组织，根据质量体积比1∶9添加匀浆液，制备匀浆。以等体积2×上样缓冲液加入，煮沸，共10 min，蛋白变性。4 ℃、12 000 r/min离心，离心半径8 cm，共5 min，取上清液，样品蛋白浓度以BCA法检测。采用上样缓冲液，对蛋白浓度进行调整，保持各泳道蛋白上样体积10 μL。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印到硝酸纤维膜，脱脂奶粉封闭，洗脱。加入MMP-2、TIMP-2一抗(1∶100)，4 ℃孵育，过夜；随后加入山羊抗兔二抗IgG(1∶2 500)，摇床，孵育，共2 h。经ECL包装、显影、照相，以Quantity One软件分析灰度值，蛋白相对含量采用各蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值的比值计算。

2 结 果

2.1 各组大鼠血压比较 治疗1周、2周、3周、4周时，各组收缩压、舒张压比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组各时段收缩压、舒张压均升高(P<0.05)；与B组比较，C组、D组、E组各时段收缩压、舒张压均降低(P<0.05)；与D组比较，C组、E组各时段收缩压、舒张压均降低(P<0.05)；E组与C组收缩压、舒张压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1、表2。

表1 各组大鼠收缩压比较 (±s) 单位：mmHg

表2 各组大鼠舒张压比较 (±s) 单位：mmHg

2.2 各组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 各组IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05)；与B组比较，C组、D组、E组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05)；与D组比较，C组、E组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05)；E组与C组IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 (±s) 单位：pg/mL

2.3 各组大鼠ROS、MDA水平比较 各组ROS、MDA水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组ROS、MDA水平均升高(P<0.05)；与B组比较，C组、D组、E组ROS、MDA水平均降低(P<0.05)；与D组比较，C组、E组ROS、MDA水平均降低(P<0.05)；E组与C组ROS、MDA水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠ROS、MDA水平比较(±s)

2.4 各组胸主动脉组织形态学变化 HE染色显示，A组大鼠胸主动脉管壁内皮较完整，未出现增生现象，中膜平滑肌有序排列，弹性纤维清晰。B组大鼠胸主动脉管壁厚度增加，内皮不完整，明显增厚，中膜平滑肌细胞排列较紊乱，弹性纤维稍增多，纹络不清晰。D组内皮增生程度减轻，部分平滑肌细胞向内膜下增生迁移，弹性纤维稍增多。C组、E组管壁无明显增厚，可见轻度内皮增生增厚，中膜平滑肌层、弹性纤维无明显病理改变，较D组改善更明显。详见图1。

图1 各组大鼠胸主动脉组织形态学变化(×400)

2.5 各组大鼠血管重塑形态学参数比较 各组大鼠MT、LD、MT/LD比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组MT、MT/LD升高，LD降低(P<0.05)；与B组比较，C组、D组、E组MT、MT/LD降低，LD升高(P<0.05)；与D组比较，C组、E组MT、MT/LD降低，LD升高(P<0.05)；E组与C组MT、LD、MT/LD比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表5。

表5 各组MT、LD、MT/LD比较 (±s)

2.6 各组MMP-2、TIMP-2蛋白相对表达量比较 各组MMP-2、TIMP-2蛋白相对表达量及MMP-2/TIMP-2比值比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组比较，B组MMP-2蛋白相对表达量、MMP-2/TIMP-2比值均升高，TIMP-2蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与B组比较，C组、D组、E组MMP-2蛋白相对表达量、MMP-2/TIMP-2比值降低，TIMP-2蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与D组相比，C组、E组MMP-2蛋白相对表达量、MMP-2/TIMP-2比值降低，TIMP-2蛋白相对表达量升高(P<0.05)；E组与C组MMP-2、TIMP-2蛋白相对表达量及MMP-2/TIMP-2比值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表6、图2。

表6 各组MMP-2、TIMP-2蛋白相对表达量及MMP-2/TIMP-2比较 (±s)

图2 各组MMP-2、TIMP-2蛋白灰度值

3 讨 论

冠心病为临床常见病、多发病，血管重塑为该病重要的病理改变之一，且为致使病情发展、恶化的关键。冠心病血管重塑主要是由机体血流动力学变化、局部生长因子形成等引发的血管结构、功能变化，可造成血压波动，且与降压治疗密切相关[10]。既往冠心病降压多应用钙通道阻滞剂、β受体阻滞剂等药物，但也存在耐药性、副作用等问题，而中医药在冠心病及其并发症防治中有独特价值。中医学认为，冠心病属于“心痛”“胸痹”等范畴，病因病机为血行不畅，血瘀内生，脉络瘀阻，阻碍气机，引发气滞；瘀血内阻，脉络不通，不通则痛，新血不生，不荣则痛，故气滞血瘀贯穿冠心病始终[11]。复方七芍降压片是一种中药复方制剂，包括三七、白芍、桑寄生、地龙、杜仲等，可化瘀息风、养阴柔肝，使阴虚得补，阳亢得平，脉络得畅，清窍得养，眩晕得止[12-13]。既往研究指出，复方七芍降压片具有良好降压效果，可改善血管内皮功能，延缓血管重塑，但其作用机制尚不明确[14]。

本研究发现，C组、D组、E组治疗各时段收缩压、舒张压均较B组降低，且MT、MT/LD均低于B组，LD高于B组，其中E组效果与C组相当；进一步分析胸主动脉形态学改变，结果显示，与B组相比，C组、E组管壁无明显增厚，可见轻度内皮增生增厚，中膜平滑肌层、弹性纤维无明显病理改变，且较D组改善更明显，说明复方七芍降压片可改善冠心病大鼠血管重塑，稳定动态血压。IL-1、TNF-α等炎性因子与心血管重塑密切相关。动物实验发现，TNF-α可促进自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖，增加动脉壁厚度，引发血管重塑[15]。冠心病、心力衰竭等疾病中，氧化应激也是引发血管重塑的一个重要因素[16]。本研究检测各组IL-1β、TNF-α、MDA、ROS表达水平发现，复方七芍降压片可剂量依赖性降低冠心病大鼠IL-1β、TNF-α、MDA、ROS表达水平，提示复方七芍降压片可减轻氧化应激、炎症反应，发挥改善血管重塑的作用。

本研究还分析了复方七芍降压片改善冠心病大鼠血管重塑、动态血压的可能机制。有学者发现，MMP-2、TIMP-2在多种因素所致血管损伤重塑过程中发挥重要作用，MMP-2/TIMP-2为血管重塑调节重要信号通路之一，其激活可引发细胞炎症反应、氧化应激反应，造成细胞损伤[17]。机体血管损伤初期，可导致MMP-2表达提升，诱发增生性修复重塑，同时TIMP-2抑制MMP-2活性作用逐渐增加，可相应减弱重塑作用[18]。相关动物实验发现，调节MMP-2/TIMP-2蛋白表达，是药物治疗改善自发性高血压大鼠血管重塑的作用机制之一[19]。本研究发现，与A组相比，B组MMP-2蛋白相对表达量升高，TIMP-2蛋白相对表达量下降，MMP-2/TIMP-2比值增大，说明冠心病大鼠存在MMP-2/TIMP-2信号通路激活，与血管重塑、血压波动密切相关。本研究还发现，复方七芍降压片可剂量依赖性调节冠心病大鼠MMP-2、TIMP-2蛋白表达，抑制MMP-2/TIMP-2信号通路，这可能是其改善血管重塑、动态血压的一个重要作用机制。说明复方七芍降压片可改善冠心病大鼠血管重塑，降低血压水平，减轻氧化应激反应、炎症反应，作用机制可能与抑制MMP-2/TIMP-2信号通路激活有关。

综上所述，复方七芍降压片可改善冠心病大鼠血管重塑，维持动态血压稳定，减轻氧化应激、炎症反应，作用机制可能与抑制MMP-2/TIMP-2信号通路有关。然而，鉴于复方七芍降压片具有较多药理活性，故其改善血管重塑、降压的其他机制仍有待进一步探讨。