有关PCR扩增过程中的疑虑与剖析

洪长根

PCR就是聚合酶链式反应的简称，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。虽然人教版教材仅用不到400个字和两幅图作了简单介绍，但基于PCR在基因工程中的重要地位，使得涉及到的训练越来越多、越来越难，相关的疑问和剖析大致有以下一些。

1 PCR原料是dATP、dTTP、dCTP、dGTP的原因

通过《必修2.遗传与进化>的学习，学生知道DNA复制的原料是四种脱氧核苷酸，但教材的图1-8中却出现了dATP、dTTP、dCTIP、dGTP。学生知道ATP是三磷酸腺苷，但不知道dATP、dTTP、dCTP、dGTP。其实dATP、dTTP、dCTP、dGTP指的是三磷酸脱氧核苷酸（dNTP），是合成脱氧核糖核酸的“最小单位”。DNA复制时，脱氧核苷酸链的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量，dNTP才能提供足够的能量，而dNMP则做不到，用这种原料所完成的反应不可逆且极易发生。因为当脱氧核苷酸链延伸一个一磷酸脱氧核苷酸（dNMP），生成焦磷酸（Fl4P207），然后焦磷酸在焦磷酸酶的催化下迅速分解为两个磷酸，使得反应的总吉布斯自由能大幅降低，这是细胞内典型的焦磷酸解驱动的反应之一。其他如糖原的磷酸解、tRNA与氨基酸的结合反应也都是焦磷酸解驱动的反应。

2 PCR-个周期的大约时间

PCR过程虽然经过复性（90-95℃）、退火（55-60℃）、延伸（70-75℃）3个基本反应步骤才能完成，但实验完成的时间却只有2～4 min，也就是说2--3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

3 引物的概念及PCR过程使用引物的原因

在PCR技术中，扩增目的基因的方法其实就是必修2中的DNA复制。那么，复制为什么要引物？这引物的化学本质是什么？复制完成后引物到哪里去了？……学生会产生出一串关于引物的疑问。

在PCR过程中之所以需要引物是因为在DNA复制中DNA聚合酶仅仅可以把新的脱氧核苷酸加到已有的DNA链上，据此可知：引物其实就是引子，是一小段单链DNA（体内DNA复制所用的引物是RNA，RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3一OH端而进入DNA链的延伸阶段），是作为DNA复制的起始点。

3.1 引物的长度

DNA复制的引物为单链DNA，其长度常用的是18-27个脱氧核苷酸，但不应大于38，因为过长的引物会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

3.2 引物的种类

DNA复制是以依解开的两条链都作模板的，PCR也不例外，故PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。

3.3 需要引物的数量

引物虽然起的作用是开始进行脱氧核苷酸链的延长，但其本质就是复制时所要合成的新链中的一段，完全没有必要在DNA合成结束后脱下来再用于下个PCR周期（体内DNA复制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。这就涉及到引物的消耗问题，如果扩增的数量大，则的消耗的引物也多，具体数据应该等于整个PCR过程中新合成的DNA单链数。

3.4 引物的结合位点

由于DNA复制只能是5'—3 '进行，而DNA的两条单链又是反向平行的，这就决定了两种引物的结合位点是模板链的3端。如果一种在左侧的话，另一种应在右侧。学生产生疑问的原因是必修2学到DNA复制产生的子代DNA是与亲代DNA -模一样的，这就意味着引物都应该结合在模板3的起始端，但训练中涉及到PCR引物结合位点都不是3的起始端，如图1所示。

为什么会出现这种差别？这是因为获取目的基因时，不可能（不容易找到这样的限制酶）正好在目的基因的前后切下来，使得获取的目的基因的前后端或多或少带有一段多余的DNA片段，为了不让多余的DNA片段进入受体细胞，进而跟着表达而影响蛋白质结构和功能。即便没有影响，也由于引物扩增跨度一般以200-500 bp为宜，特定条件下才扩增长至10 kb的片段。所以，引物设计的结合位点一般是在目的基因起始序列附近。

4 PCR的过程中出现3种不同长度的DNA链的原因

4.1 以原始模板为模板合成的是长链

从基因文库中最初获取的DNA经热分开后的就是两条长度最长的原始模板，以此为模板合成新单链时。引物是从3端开始延伸，但引物前的模板（5端的一小段）不能被复制，复制的产物就是长链。长链比原始模板缺了一端的序列，因此，其长度不如原始模板。

4.2 以长链为模板合成的是短链

当PCR进入第二周期后，引物与新合成的长链结合时，也不能从开始部位结合，因为原始模板3端在上个周期复制时都复制出来了。由此可知，以长链为模板复制出来的新链又比长链短了一点，名为短链。

4.3 以短链为模板合成的也是短链

从第三个周期开始，将出现以短链为模板复制出的与短链等长的新链，这样复制出的子代DNA就是平时所说的通过PCR克隆出来的目的基因。

5 PCR扩增过程中各种DNA链的变化规律

在PCR扩增过程中，理论上讲DNA分子总数为2''（n为PCR循环数），各种DNA单链总数为2×2''，但在实际反应中并不能达到理论值。因为，反应初期DNA片段的增加是正常的，但随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段的数量就会降下来甚至停止，这称作平台期。一般情况下正常的增长大约是30个循环左右。好在训练也只涉及到最初几个循环的计算，具体的变化规律如下。

5.1 原始模板链的数量

原始模板永远只有两个。因为以原始模板为模板复制出的新链是长链（其长度比原始模板短一点）。

5.2 长链的数量

既然用原始模板能复制出来的是长链，原始模板又永远只有两个，这样就能保证每经过一个反应周期，长链就可以增加2个。又由于以长链为模板复制出的新链为短链（其长度比长链还短一点），二者合起来计算，长链的变化规律是：PCR循環一次增加2条。

5.3 短链的数量

短链的情况有点复杂，从模板的角度分析的结果是以长链为模板复制出的新链是短链，当短链出现后，再以短链为模板复制出的新链也是短链;从时间的角度分析的结果是第一个反应周期没有短链产生，第二个反应周期通过以长链为模板首次复制出短链，到第三个反应周期时，就会以两种模板同时复制出短链。关于短链的数量变化可以认为是按指数倍数增加的，但找不到一个简单的数学式来表达，若要求某个反应周期后的短链数，只能根据DNA单链总数、原始模板数和长链数来推算。好在这三个数据都是简单而有规律的，相关推算可以参考图2进行。