沙棘总酚酸对胃癌细胞MGC-803增殖、迁移和细胞周期的影响

赵 阳，王海生

（内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059）

沙棘是一种落叶性灌木，属胡颓子科，又名为黑刺、醋柳、酸棘。它是一种耐旱耐寒植物[1]。我国是世界上沙棘种植面积最大，品种最多的国家，在我国主要分布在华北，西北等地区[2]。沙棘不仅有水土保持的作用，而且具有很高的药用价值。沙棘是一种药食两用植物，它含有许多生物活性物质，包括维生素、不饱和脂肪酸、酚类化合物、类黄酮等[3]。其主要活性成分是酚酸类化合物，其中总酚酸在抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等方面效果显著[4]。

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围排第四[5]。胃癌是导致全球癌症相关死亡的主要原因，亦是我国癌症死亡的主要原因之一[6～8]。目前，胃癌的治疗方法主要包括手术和化疗[9，10]，但效果往往不甚理想。因此寻找一种能够有效治疗或者控制胃癌并改善患者预后的药物，具有重要意义。经查阅文献发现，对于沙棘总酚酸治疗胃癌的研究目前尚未见报道。因此本研究通过观察沙棘总酚酸对胃癌细胞生物学行为的影响，尝试探索其对胃癌的作用及机制，从而为沙棘的实验研究提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 沙棘总酚酸的提取

准确称量沙棘果1g，捣碎后加入25mL70%乙醇，加热回流1h，冷却，过滤，之后再加入30mL70%的乙醇，重复以上步骤，最后收集在100 mL量瓶中，用相同体积分数的乙醇清洗残留后收集，再加一定量的70%的乙醇达到100mL，混合均匀，测定含量。

1.2 细胞

MGC-803细胞由内蒙古医科大学实验室提供

1.3 主要试剂

胎牛血清、RPMI-1640、青链霉素混合液、胰蛋白酶（含酚红和0.25%EDTA）购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，4%多聚甲醛、结晶紫购自北京Solarbio公司，transwell小室购自美国corning公司，DNA含量检测试剂盒（细胞周期），总RNA提取试剂盒购自北京天根，反转录试剂盒购自大连宝生物，qPCR试剂盒购自日本toyobo。

1.4 主要仪器

超净工作台（美国Thermo），恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司），CO2培养箱（美国Thermo），低速冷冻离心机（安徽中科中佳），倒置显微镜（德国Leica），流式细胞仪（美国beckman），酶标仪（美国perkin elmer），荧光定量PCR仪（美国ThermoPikoReal）。

2 方法

2.1 CCK-8方法

取对数生长期的MGC-803细胞消化重悬为3×104个/mL，分别在三个96孔板均匀加入100μL，设空白调零组，阴性对照组和沙棘酚酸给药组（1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL），培养24h，48h，72h后，弃掉旧培养基，各孔中加入含10μLCCK8的培养基，之后将96孔板放入培养箱内，3.5h后用酶标仪测定波长450nm处的吸光度值，计算IC50值。细胞抑制率=[（阴性对照组平均OD值－实验组平均OD值）/（阴性对照组平均OD值-空白调零组平均OD值）]×100%。

2.2 Transwell实验法

将对数生长期的MGC-803胃癌细胞调整密度为1X10^6个/mL，上室内200μL细胞悬液，10%血清培养基500μL加入下室，48h后吸去小室的培养基，棉签轻轻擦拭小室内部，4%的多聚甲醛固定，之后用0.1%结晶紫染色，洗去多余结晶紫，随机选取10个高倍视野（200倍镜）计数迁移细胞数。

2.3 流式细胞术

取对数生长期的MGC-803胃癌细胞设置阴性对照组，沙棘酚酸给药组（2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL），培养48h后，用PBS洗两次，消化离心后弃上清液，用预冷PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1X10^6个/mL，加500μL预冷的70%酒精，4℃冰箱固定过夜。次日离心5min，弃上清，加入100μLRNase A，放入37℃恒温培养箱，30min后加入400μL PI荧光染料混匀，在4℃冰箱避光放置30min，流式细胞仪检测。

2.4 qRT-PCR技术

TRIzol法提取总RNA，性质稳定的cDNA由RNA逆转录试剂盒逆转录。qRT-PCR检测目的基因相对GAPDH表达水平。反应条件设定如下：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火55℃，10s；延伸72℃，15s；40个循环；融解曲线55℃～95℃。引物序列（见表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.5 统计学方法

应用SPSS 25.0统计软件分析数据，计量资料符合正态分布，以表示，两组间比较采用独立样本t检验，检验水准为α＝0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 沙棘酚酸对胃癌细胞增殖能力的影响

CCK-8结果显示，不同浓度的沙棘酚酸分别处理胃癌MGC-803细胞24h、48h、72h后，与对照组相比，处理组的MGC-803细胞增殖受到明显抑制作用，并且抑制效果呈时间-剂量依赖性。不同浓度沙棘酚酸组作用于72h时，与对照组比较，5mg/mL和6mg/mL沙棘酚酸组差异具有统计学意义，细胞生长被显著抑制。经GraphPad Prism 6软件计算，沙棘酚酸作用细胞24h、48h、72h的IC50值分别为4.893mg/mL、4.311mg/mL、4.106mg/mL（见图1）。考虑到IC50值及细胞毒性作用，选用2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL进行后续实验。

图1 沙棘总酚酸对MGC-803细胞抑制率的影响Fig.1 Effect of total phenolic acid of sea-buckthorn on inhibition rate of MGC-803 cells

3.2 沙棘酚酸对胃癌细胞迁移能力的影响

transwell实验结果显示，沙棘酚酸作用胃癌MGC-803细胞48h后，与对照组相比，三个处理组穿膜细胞数明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05），且沙棘酚酸对MGC-803细胞迁移能力的抑制作用呈浓度依赖性（见图2）。

图2 Transwell小室中细胞结晶紫染色图（x200）以及细胞迁移数的柱状图：a表示0mg/mL；b表示2mg/mL；c表示3mg/mL；d表示4mg/mLFig.2 Crystal violet staining of cells in Transwell chamber(X200)and the histogramof cell migration number:a 0mg/mL；b 2mg/mL;c 3mg/mL；d 4 mg/mL

3.3 沙棘酚酸对胃癌细胞周期的影响

沙棘酚酸作用胃癌MGC-803细胞48h后，与对照组相比，三个处理组G0/G1期和S期的细胞比例显著降低，而G2/M期的细胞比例显著升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），且沙棘酚酸对MGC-803细胞周期的抑制作用呈浓度依赖性。结果表明，沙棘酚酸对胃癌MGC-803细胞的的周期有显著抑制作用，能将其阻滞于G2/M期（见图3、4）。

图3 沙棘总酚酸对细胞各周期影响的流式直方图：a表示0mg/mL；b表示2mg/mL；c表示3mg/mL；d表示4mg/mLFig.3 Flow histogram of the influence of total phenolic acid of seabuckthorn on each cell cycle:a 0mg/mL；b 2mg/mL；c 3 mg/mL；d 4 mg/mL

3.4 qRT-PCR结果显示

沙棘酚酸作用胃癌MGC-803细胞48h，各目的基 因的2-ΔΔCT值 分 别为E-cadherin（0.42±0.05）、Gsk-3β（0.10±0.01）、SFRP（5.78±0.37），与对照组比较，SFRP是对照组的（5.78±0.37）倍，SFRP基因被上调，差异具有统计学意义，E-cadherin和Gsk-3β基因表达下调，差异具有统计学意义（见图5）。

图5 加药前后各目的基因的2-ΔΔCT值柱状图Fig.5 The purpose gene 2-before and after the dosingΔΔCT value histogram

图4 不同浓度沙棘总酚酸对胃癌细胞MGC-803各周期的影响Fig.4 Effects of different concentrations of seabuckthorn total phenolic acid on each cycle of MGC-803 in gastric cancer cells

表2 不同组中各目的基因的相对表达量（±s）Tab.2 Relative expression levels of each target gene in different groups（±s）

表2 不同组中各目的基因的相对表达量（±s）Tab.2 Relative expression levels of each target gene in different groups（±s）

沙棘总酚酸浓度（mg/mL）目的基因ΔCT值（images/BZ_18_570_715_591_745.png±s）E-cadsin 18.93±0.06 20.21±0.24 0 4 GSK-3β 9.91±0.21 13.23±0.13 SFRP 23.87±0.22 21.34±0.13

4 讨论

胃癌是一种发病率高，死亡率高的恶性疾病[11]。目前临床治疗以手术结合化疗为主，副作用大，效果有限[12，13]。随着中草药抗肿瘤作用的深入研究，发现部分中草药中的活性成分对肿瘤具有很好的抑制作用，对抗肿瘤药物的研究具有重要价值。总酚酸作为沙棘中一种有效的抗肿瘤活性成分，现有文献中对其抗肿瘤研究相对较少，因此本研究通过观察沙棘总酚酸对Wnt／β-catenin的异常激活是已知的人类癌症中常见的异常信号调节通路，因此，有必要探索该信号通路中的靶位点并寻找相应的有效作用物，以抑制癌细胞中Wnt通路的异常活化，从而为癌症治疗提供一种可能。Wnt/β-catenin信号传导途径是一类传导生长刺激信号的通路，由细胞外的Wnt蛋白、膜受体Frizzled、胞质内的β-catenin及下游的转录因子组成[14]。βcatenin可与E-cadherin胞内区结合形成P-catenin/E-cadherin复合体，再与肌动蛋白骨架相连，减弱细胞间黏附，诱导肿瘤的EMT过程从而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[15]。GSK-3β通过抑制βcatenin蛋白来抑制癌细胞的增殖。SFRP属于分泌型糖蛋白，与Wnt结合，从而竞争性抑制Wnt与Frz／LRP受体结合，而阻遏信号通路的传导。

细胞周期失调与肿瘤细胞的发生发展密切相关[16]，细胞周期由四个有序和严密的调控阶段组成（称为G1、S、G2和M）。DNA合成（S期）是两个子细胞的分离，M期是主要的细胞周期进展，S期之前的周期是G1期，为这些细胞准备DNA合成。正常的细胞周期如果失去调控，则会导致肿瘤细胞无限增殖[17，18]。

本研究以人胃癌MGC-803细胞为研究对象，检测并研究沙棘酚酸对胃癌细胞增殖，迁移和周期的影响及机制，为沙棘酚酸抗肿瘤提供实验依据。增殖实验结果显示，沙棘酚酸作用于胃癌MGC-803，随着沙棘酚酸浓度的升高，MGC-803细胞的增殖能力逐渐减弱，说明沙棘酚酸对于MGC-803细胞的生长具有抑制作用。细胞周期实验结果显示，沙棘酚酸将胃癌细胞阻滞在G2/M期。说明沙棘酚酸对胃癌MGC-803细胞的周期具有抑制作用。迁移实验结果显示沙棘酚酸抑制胃癌MGC-803的迁移并呈浓度依赖性，为了探讨可能的机制，本研究测定了相关基因E-cadherin、GSK-3β和SFRP的表达情况，发现沙棘酚酸下调E-cadherin、GSK-3β，上调SFRP。

综上所述，沙棘酚酸在胃癌中具有抗肿瘤效应，能够抑制胃癌MGC-803细胞增殖且呈浓度依赖性，沙棘酚酸还可以抑制胃癌细胞的迁移运动，并阻滞细胞周期在G2/M期，调节Wnt/β－catenin信号通路相关基因的表达。沙棘酚酸安全性高，且可有效抑制胃癌细胞生长，可为将来临床治疗胃癌，尤其是进展期胃癌及化疗药物效果不好的患者提供新的治疗方向。