RNA干扰HDACl对人乳腺癌MCF—7细胞生物活性的影响

胡武杰　刘志明　吴斯敏　全军利　李建林

[摘要]目的：通过RNA干扰乳腺癌MCF-7细胞组蛋白去乙酰化酶1（HDACI）基因，观察对其细胞周期及细胞生长的影响。方法：将乳腺癌MCF-7细胞分成3个组：空白对照组（不予任何处理）、阴性对照组（予以阴性siRNA+脂质体）、siRNA组（HDACl siRNA+脂质体）。人工合成针对HDACl基因的小分子干扰RNA构建HDACI-siRNA重组质粒，通过脂质体转入乳腺癌MCF-7细胞。用Real Time-PCR法和Western-b10t法分别检测HDACl基因的mRNA及蛋白表达情况；MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期变化。结果：转染24h后人乳腺癌MCF-7细胞中HDAClmRNA表达量在siRNA组为（0.15±0.02）、空白对照组为（1.00±0.03）、阴性对照组（0.83±0.04）。与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA组细胞中HDAClmRNA表达量下降明显（P<0.05）。Western b1ot显示HDACl蛋白表达量亦明显显示：siRNA组表达量比空白和阴性对照组低（P<0.05）。MTT法检测显示3组细胞中，siRNA组的细胞生长速度较其他两组慢（P<0.05）。流式细胞术检测显示3组乳腺癌细胞细胞周期分布显示siRNA组细胞周期s期明显减少（P<0.05），G1期比例增加（P<0.05）。结论：通过RNA干扰能有效的抑制人乳腺癌MCF-7细胞HDAC1的表达，同时抑制细胞增殖、引起细胞周期停滞。

[关键词]HDAC1；细胞增殖；细胞周期

组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC），是一对功能相互拮抗的蛋白酶，共同负责调控组蛋白的乙酰化与去乙酰化。正常细胞体一旦出现核内组蛋白乙酰化与去乙酰化的失衡，即会导致正常的细胞周期与细胞代谢行为的改变而诱发肿瘤。已有研究表明，由于这对拮抗酶活性的改变，导致组蛋白在转录水平异常修饰，导致异常表达。

在组蛋白去乙酰化酶众多亚型中，HDAC1在肿瘤的发生发展的关系中是具有代表性的。同时发现HDAC1的表达水平与患者生存率，肿瘤的大小有关。因此HDAC1可以作为一个独立的乳腺癌临床预后指标。其机制可能因为下调HDAC1后，是HDAC1 mRNA和蛋白表达量减少。

本实验旨在通过RNA干扰的手段，下调乳腺癌MCF-7细胞中HDAC1基因的表达，使HDAC1基因表达减少，从而抑制细胞增长、使细胞周期发生改变。

1材料与方法

1.1细胞及主要试剂

乳腺癌MCF-7细胞（上海生物工程公司）。DMDM（美国Gibco公司）；小鼠抗人HDAC1单克隆抗体及羊抗小鼠二抗购自（美国SANTA CRUZ）公司；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；Real Time-PCR检测试剂盒购自（上海吉马技术制药有限公司）公司；胎牛血清购自（维森特生物技术有限公司）公司；双抗购自Gibco公司。

1.2主要的设备

CO₂培养箱（3111，美国Thermo）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、常温离心机（3300，德国Eppend～f公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、SDS-PAGE蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）、PCR仪（美国Applied Biosystems公司）

1.3细胞培养

乳腺癌MCF-7细胞培养于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO₂体积分数的恒温培养箱中培养。

1.4 RNA干扰片段的合成

siRNA序列委托上海吉玛公司合成，同时合成随机性阴性对照序列。HDAC1siRNA正义链：5'一GCUCCUCUGACAAACGAAUTT-3'，反义链5'-AUUCGUUUGUCAGAGGAGCTT-3'。阴性的siRNA正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'反义链-5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

RNA干扰具体转染步骤参照上海吉玛公司转染操作手册。转染6～7h后换成无双抗的DMEM培养液，之后常规培养，转染24小时后做后续处理。

1.5 Real Time-PCR法检测乳腺癌HDAC1细胞中HDACl的表达

搜集转染后各组HDAC1细胞，采用Trizo法提取总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，检测HDAC1、β-actm'的表达。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。β-actm'为内参照计算相对表达量（RQ）

1.5Western blot法测MCF-7细胞中HDAC1蛋白的表达

提取并分离各组总蛋白，将分离后的蛋白转移至硝酸纤维膜上，封闭转移膜，分别加入一抗（兔抗人HDAC1多克隆抗体以及β-actin单克隆抗体）反应过夜，随后加入二抗反应2小时暗室发光显影。以Quantity One v462图像分析软件对图像进行分析，以目的条带与β-actin灰度值的比值作为蛋白表达相对含量。

1.7细胞增殖检测

采用MTT法进行细胞增殖检测。取对数生长期的MCF-7细胞，接种在96孔培养板上，每孔细胞数1×10⁵/孔。实验各组每组设5个平行孔。分别转染各组。于转染后（0h、24h、36h、48h、72h、96h）向每孔加入5mg/μlMTT溶液20μl。避光培养4小时，吸除上清液。每孔加入150μlDMSO，震荡10分钟，使形成的晶体充分溶解。测定570nm处吸光度（A）值，根据A值绘制细胞生长曲线。

1.8流式细胞术检测细胞周期变化

收集各组转染后的细胞，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁶个/mL；收集各组细胞，随后用70%冰乙醇溶液分散固定细胞；PBS洗涤后弃上清液，加入1%Triton X-100、0.01%RNase和0.005%PI的混合液，摇匀后静置25mm，用400目丝网过滤后上机分析，检测细胞周期。

1.9统计学分析

统计分析采用SPSS13.0统计软件包完成，计算资料组间差异，采用方差分析（ANOVA），组间两两比较采用S-N-K检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Real-Time PCR结果

HDAClsiRNA转染乳腺癌细胞36小时后，提取三组细胞的总RNA，以Real-TimePCR检测扩增曲线。空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组的表达量分别为（1.0±0.03）、（0.83±0.01）、（0.15±0.002）。与空白对照组和阴性对照组相比，siRN转染组细胞HDAC表达量明显降低（P<0.05）。表明细胞转染HDAClsiRNA后HDAClmRNA表达水平明显降低。

2.2 Western blotting检测HDAC1蛋白的表达

Western bloting结果显示：在空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组的三个组中，siRNA转染组的HDAC1基因明显下调，相比另外两组条带亮度明显要弱，参照GADPH，灰度分析显示下降了59%，而空白对照组和阴性对照组的HDACI基因无明显变化，表明转染的反义基因有效的下调了HDAC1，阻断了其表达，如图1所示。

2.3细胞增殖检测

HDAClsiRNA瞬间转染对乳腺癌MCF-7细胞株增殖的影响。以MTT法检测乳腺癌MCF-7细胞株瞬间转染HDAClsiRNA 24h、36h、48h、72h后细胞的生长情况，与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA组细胞的生长明显变慢（P<0.05），但空白对照组与阴性对照组无明显差异（P>0.05）。提示下调HDAC1的表达后，细胞的生长受到抑制。

2.4细胞周期检测

转染乳腺癌细胞36小时后，用流式细胞术检测3组不同细胞周期的变化。如下表所示，与空白对照组与阴性对照组相比，通过RNA干扰下调HDACl的表达，细胞周期出现了明显的变化，呈现G1、G2期阻滞、s期减少，表明通过通过RNA干扰下调HDACl的表达，有效的改变了siRNA转染组的细胞周期（P<0.05）。

3讨论

在所有HDACs中，HDAC1与肿瘤的关系具代表性，有研究者在肺腺癌、胃癌、HL-60细胞、胰腺癌、妇科肿瘤证实RNA干扰HDAC1基因，可以下调HDAC1的表达，随之诱导细胞凋亡，抑制增殖。由于组蛋白乙酰化异常导致肿瘤的发生，导致转录水平发生异常，因此以此作为靶点治疗是一种全新的治疗途径。

通过实验将HDAC1基因沉默后，可引起癌细胞有丝分裂减少，细胞凋亡增多，同时细胞的生长受到一定程度的抑制，停滞在G1或G2M期。Silvia等证明人肿瘤细胞缺乏HDACl不能进行有丝分裂，而是通过Caspase-3激活途径进入凋亡，同时细胞周期停滞在G1期或G2/M过渡期，从而抑制肿瘤细胞的生长，故剔除HDAC1的表达能抑制肿瘤生长。

在乳腺癌的实验研究中，有人通过正向干预HDAC1，结果显示组蛋白去乙醌化酶I（HDAC1）的表达可促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。同时，构建的反义HDACI质粒导入MCF-7细胞，通过下调HDAC1基因，引起了细胞的增殖抑制及周期阻滞，表明HDAC1在乳腺癌MCF-7细胞中其乙酞化与去乙酸化修饰可能起重要作用。

本实验旨在通过RNA干扰的手段，下调乳腺癌MCF-7细胞中HDAC1基因的表达，从而抑制细胞增长、使细胞周期发生改变。转染后发现转染组的HDAC1mRNA表达在干扰后能出现明显的下降（P<0.05），HDAC基因蛋白的表达亦有明显的下降（P<0.05），表明通过RNA干扰后能有效的阻断了HDAC1的表达。MCF-7细胞株转染后细胞增长比空白对照组和阴性对照组增长速度明显降低（P<0.05）。提示下调HDAC1的表达，细胞的生长受到抑制。与空白对照组与阴性对照组相比，通过RNA干扰下调HDAC1的表达，细胞周期出现了明显的变化，呈现G1、G2期比例增高、s期比例减少，表明通过通过RNA干扰下调HDAC1的表达，有效的改变了siRNA转染组的细胞周期（P<0.05）。

综上所述，HDAC1siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞株HDAC1mRNA及蛋白的表达；在体外能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长增殖，诱导细胞周期发生阻滞。本研究提供了HDAC1在乳腺癌细胞中的选择性作用谱，这为选择性靶基因治疗发展提供了新的有力的途径。但HDAC1 siRNA抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞的机制有待进一步研究。