三氧化二砷对人大细胞肺癌NCI—H460细胞凋亡影响的研究

王崇　张程　张湘燕　姚红方　张小润

摘要：目的 研究在临床上，三氧化二砷（As2O3）对人大细胞肺癌（NCI-H460细胞）细胞增殖、凋亡的影响，以探讨新的肺癌治疗方法。方法 配制NCI-H460细胞的细胞悬液（浓度为5×104个/mL），给予不同浓度的As2O3干预，并将其分为4组浓度分别为：10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L ，各组干预时间分别为24、48、72 h。细胞增殖抑制率通过MTT法检测，各组细胞形态学的改变通过镜下观察；细胞凋亡的形态学的变化通过原位末端标记法（TUNEL）检测，并与阴性对照组进行比较；按上述干预浓度及干预时间，使用流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果 As2O3对NCI-H460细胞增殖的抑制率随时间延长和浓度增加而增加（P<0.05）， 凋亡指数随时间延长和浓度增加而增加 （P<0.05）。结论 As2O3可抑制NCI-H460细胞增殖，诱导其凋亡，且呈时间、剂量依赖性。

关键词：三氧化二砷；大细胞肺癌；NCI-H460细胞；细胞增殖；细胞凋亡

三氧化二砷，分子式为As2O3，别名：砒霜，是具有代表性的砷化合物，主要用于治疗胃癌，胰腺癌、梅毒、结核等[1]，并在治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）过程中有着显著的疗效[2]。因其缓解率高， 和其他抗癌药物无交叉反应性，无骨髓抑制和严重毒副作用而获得了广泛重视，并被美国FDA批准用于APL的治疗。临床研究表明，As2O3对实体肿瘤如肺癌（A549細胞）、胰腺癌、胃癌等具有良好的抗癌作用。国内外报道多见应用As2O3作用于多种肺癌细胞方面，如Anip973细胞、NCI-H69细胞、A549细胞的凋亡，但是很少见到有关As2O3诱导NCI-H460细胞凋亡的报道，继而本实验选择NCI-H460细胞，观察As2O3对该细胞增殖及凋亡方面的影响，为临床上寻找对该类肿瘤新的治疗方法，提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 细胞 NCI-H460细胞 （由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供）。

1.2试剂 As2O3（哈尔滨伊都药业）细胞凋亡检测试剂盒（瑞士Roche 公司）；RPMI-1640培养液、 胎牛血清（美国HyClone公司）。

1.3仪器 Bio-Rad 550 酶标仪（美国 Bio-Rad公司）；TS100倒置微镜 （日本Nikon公司）； JNOECXS-212-202生物显微镜 （南京江南光电集团股份有限公司）；流式细胞仪（BDFACSAria）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 参见张小润、王晓宇等研究类似[3]。

1.2.2 MTT法测定As2O3对NCI-H460细胞的生长抑制率 显微镜下观察细胞，呈现对数生长期，0.25%胰酶消化成细胞悬液，离心1000 rpm/min、10 min，用含10%胎牛血清及青链霉素混合液的RPMI-1640全培养液稀释细胞浓度约5×104个/ml。将100 μl/孔的细胞悬液加入到96孔培养板中，共设4个平行组，每组设3个复孔，同时设1组阴性对照组（100 μl无药物干预的上述细胞悬液），5%CO2，37℃条件下培养24 h使细胞贴壁，然后每孔加入以生理盐水溶解的不同浓度的As2O3（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）50 μl，并向对照组加入细胞培养液50μl，设定24 h、48 h、72 h为上述5组的反应时间，带反应时间到达后，吸去原培养液并用生理盐水冲洗各孔，然后向各孔加入20 μl MTT，并于4 h后加二甲亚砜（DMSO）200 ul于每孔中，使用酶标仪测量吸光度OD（490 nm波长），对应3个复孔，反复3次实验每组浓度。细胞抑制率%=（1-给药组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.3细胞凋亡的形态通过原位末端转移酶标记法（TUNEL）法检测 同2.2操作得到细胞悬浮液5×104个/ml，将细胞悬液转到24孔板中培养，400 μl/孔，共设4个平行组，每组设3个复孔，同时设置1正常对照组孔（不加药），37℃，5% CO2条件下培养24 h使之贴壁，然后加入200 μl不同浓度的As2O3（生理盐水溶解），药物终浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分别作用24 h、48 h、72 h，到实验时间后，进行凋亡检测，具体步骤参见张小润、王晓宇等研究[3]。

1.2.4流式细胞仪检测细胞的凋亡指数 使用上述同样的方法将细胞浓度稀释至5×105/ml，将细胞悬液转到6孔板中培养，2 ml/孔，共设4个平行组，每组设3个复孔，同时设置1正常对照组孔（不加药），37℃，5%CO2条件下培养24 h使之贴壁，然后加入1000 μl不同浓度的As2O3（生理盐水溶解），药物终浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分别作用24 h、48 h、72 h，到实验时间后，进行凋亡检测，具体步骤见试剂说明书，凋亡指数=（Q1+Q2）×100%。

1.3统计学处理 数据用SPSS 17.0统计软件进行统计分析、处理，数据以（x±s）差表示，组间多样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCI-H460细胞形态变化 在不同浓度As2O3作用后，NCI-H460细胞随着药物浓度的增加、干预时间延长， 部分NCI-H460细胞胞浆内开始有空泡形成，细胞轮廓明显，少部分细胞脱落，漂浮于培养液中；亦有少数细胞体积增大，胞体肿胀、破裂，呈坏死状。

2.2 As2O3对NCI-H460细胞增殖抑制率的影响As2O3能抑制NCI-H460细胞增殖，并呈时间、剂量依赖性。不同浓度As2O3作用不同时间后NCI-H460细胞增殖的抑制率比较，浓度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L作用24 h后NCI-H460细胞形态，见图1，表1。

图1 浓度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L As2O3

作用24 h后NCI-H460细胞形态（×200）

2.3 As2O3对NCI-H460细胞凋亡的形态学的影响 TUNEL染色，陰性组见蓝色的凋亡阴性染色；阳性组凋亡细胞核呈棕黄色，细胞呈小片或散在分布，细胞核碎裂、溶解，形状不一，易于观察，伴随不断增大的药物浓度，可见棕黄色的凋亡细胞的分布不断扩大，见图2。

图2 TUNEL法检测不同浓度As2O3作用于

NCI-H460细胞24 h后的凋亡图形

注：A：0 μmol/L；B：10 μmol/L；C：80 μmol/L。

2.4 NCI-H460细胞的凋亡指数通过流式细胞仪检测 在不同时间、不同浓度下As2O3对NCI-H460细胞凋亡作用的影响可通过流式细胞仪观察；随着剂量的增加，时间的延长，细胞的的凋亡指数在不同时间下呈进行性升高。数据表明，NCI-H460细胞的凋亡与As2O3的诱导有明显关系，并与剂量和时间呈现依赖相关性。（通过图3能够发现，随着药物浓度的增加，Q1+Q2的比例不断扩大），见表2，图3。

图3 流式细胞仪检测10 μmol/L As2O3作用于

NCI-H460细胞不同时间的凋亡指数的比较

注：A：24 h，B：48 h，C：72 h。

3 讨论

肺癌，为最常见的肺部恶性肿瘤，分为小细胞肺癌及非小细胞肺癌，后者中又以大细胞肺癌恶性程度最高，虽传统治疗以手术为主，但是因其转移快，手术后预后亦欠佳，故化疗在其治疗过程中起着极其重要的的作用。目前，很多研究显示，绝大多数药物是通过抑制细胞的生长、增殖，诱导细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用的。

三氧化二砷，俗称砒霜，近年来许多报道发现，As2O3在血液系统肿瘤的治疗中发挥着明显的抗癌作用，受到全世界的瞩目如急性早幼粒细胞白血病[4]。大量实验证实，As2O3可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡，且As2O3在抑制肿瘤细胞增殖方面与其他药物相比具有多途径的优势；其次，As2O3在毒副作用和抗癌广谱性方面与其他抗癌药物相比也具有明显的优势[5-8]。研究发现，As2O3治疗各种实体瘤如胃癌、胰腺癌和肺癌的主要机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。

刘琳[9]等国内学者研究发现对于人的大肠癌细胞，给予As2O3 3 d的剂量，并作用24 h、48 h、72 h，能诱导癌细胞凋亡，并可见凋亡形态学变化。借鉴该项研究经验，制定本次试验的药物As2O3浓度分别10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，干预时间为24 h、48 h、72 h。现代的检测凋亡的方法有流式细胞仪检测法、MTT法、TUNEL法，其中流式细胞仪检测法具有准确性好、精度高、速度快等优点。在本次试验中，分别使用这三种检测方法以探讨As2O3对NCI-H460细胞凋亡及细胞增殖指数的影响。其中MTT法，采用不同时间及浓度的As2O3作用于NCI-H460细胞，并通过显微镜下观察。结果显示，阴性对照组细胞折光性好，贴壁良好，无脱落，呈梭行或者不规则形。对于药物干预组，细胞逐渐变圆，细胞轮廓更加明显，部分NCI-H460细胞胞浆内有空泡形成，且折光性差，甚至在细胞培养液中出现脱落漂浮现象，随着药物浓度和作用时间的的增加，细胞的具有更明显的形态变化。

本次实验中，在不同时间及不同浓度下，As2O3作用于NCI-H460细胞，排除部分因检测误差和标本例数少等原因造成浓度抑制率、作用时间和凋亡指数无明显差异性变化。从总趋势上来说，As2O3不同时间及不同浓度下对NCI-H460细胞的增殖具有抑制作用，并且和时间以及剂量呈现相关依赖关系，这与韦国桢，曹琦[10]和Chow等[11]的研究结果类似，从而可作出推断，As2O3可抑制NCI-H460的增殖，并与时间和剂量呈现可能的相关依赖关系；另外，姚和瑞[12]等的研究表明，As2O3可以诱导肺癌细胞（NCI-H69）凋亡，并且凋亡指数与浓度的增大呈进行性上升关系，同样揭示了As2O3能够诱导NCI-H460细胞凋亡，并具有与时间及剂量的相关依赖性。本次研究中检测NCI-H460细胞的凋亡指数采用的是流式细胞仪，也发现As2O3能诱导NCI-H460细胞凋亡，并且凋亡指数与剂量及时间相关依赖关系，同样可推断出，As2O3能够诱导NCI-H460细胞凋亡，并具有与时间及剂量的相关依赖性。与其他相关报道结合，可以看出化疗抗肿瘤的机制可能与多种化疗药物干涉多种癌基因的表达有关，如基因bcl-2，P53等，还有报道更详细的指出，三氧化二砷可以通过下调表达bcl-2基因与上调表达P53基因有关[13]，更进一步明确三氧化二砷抗肿瘤的机制，有待于更深层次的完善相关实验。

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编辑/翟辰万