益气养血补肾方对长期大强度运动大鼠海马JAK/STAT信号转导通路的影响

吴春燕等

摘 要：目的：研究复方中药益气养血补肾方对长期大强度运动大鼠海马JAK/STAT信号转导通路的影响，进一步探讨该中药的神经保护作用及机制。方法：30只雄性SD大鼠随机分为对照组、大强度运动组和中药组，每组10只。其中，大强度运动组和中药组进行递增负荷跑台训练，时间为7周。用TUNEL法检测大鼠海马细胞凋亡情况，用Western-blotting法测定海马磷酸化JAK1、STAT1及Casepase-3的蛋白表达水平。结果：与对照组相比，大强度运动组细胞凋亡水平和p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）；中药组细胞凋亡水平和p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的蛋白表达水平则明显低于大强度运动组（P<0.05，P<0.01）。结论：长期大强度运动可能激活JAK/STAT信号转导通路，发挥促凋亡作用，参与脑缺血损伤后的病理生理过程；复方中药益气养血补肾方可能通过抑制p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的表达发挥脑缺血后的抗凋亡作用，从而达到神经保护作用。

关键词：长期大强度运动；海马；细胞凋亡；JAK/STAT信号通路；益气养血补肾

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2015）03-0057-05

Abstract：Objective： To study the effects of compound Chinese medicine on the signal pathway of JAK/STAT in rat hippocampus with long-term high intensity exercise.Methods：Male SD rats were randomly divided into three groups： control group （n=10），high intensity exercise group（n=10） and Chinese medicine group （n=10）. The exercise project was applied by 7 weeks treadmill at progressive increase exercise intensity.The level of apoptosis in rat hippocampus was detected by the methods of TUNEL. The level of protein expression of p-JAK1， p-STAT1 and Casepase-3 were determined by the methods of Western blotting.Results：Compared with the control group， the level [HK][HT]

长期大强度运动可使机体脑部血流量下降，氧供相对不足，能量代谢障碍，兴奋性氨基酸、氧自由基、一氧化氮等释放增加，细胞内钙超载，炎性细胞聚集等，出现缺血、缺氧性损伤，从而引起脑组织细胞凋亡，神经系统功能下降。细胞凋亡在脑缺血损伤中起到重要作用，信号转导过程的激活是启动细胞凋亡的前提，JAK（Janus kinase，JAK激酶）-STAT（signal transducers and activators oftranscription，信号传导子和转录活化子）通路是与脑缺血损伤后细胞凋亡密切相关的重要细胞存活信号转导通路之一[1]，是近年来分子生物学领域研究的热点。脑组织缺血时引起大量细胞因子和生长因子的释放，能够激活JAK/STAT信号转导系统，继而对缺血后神经细胞的存亡有非常重要的意义，能够调控脑缺血引起的细胞凋亡，而JAK1/STAT1信号转导途径是其中的一条重要路径，与神经细胞凋亡的关系较为密切，STAT1可活化促凋亡caspase级联反应发挥直接的促凋亡作用。

传统的中医药在运动疲劳的消除方面具有独特的优势。中医药在运动疲劳的恢复方面具有独特的优势。在本人的前期研究中已经证实[2-3]，复方中药益气养血补肾方可以通过抗氧自由基，调节神经递质水平，提高神经营养因子水平等发挥神经保护作用。本研究以JAK/STAT信号通路为切入点，通过建立大强度运动模型，观察长期大强度运动下大鼠海马神经细胞凋亡及JAK/STAT信号通路相关分子p-JAK1、p-STAT1和casepase-3蛋白表达水平的变化，研究该运动方式对JAK/STAT信号转导通路的影响，探讨大强度运动引起的脑缺血后神经细胞凋亡的信号转导机制。并用复方中药益气养血补肾方进行干预，从细胞凋亡及JAK/STAT信号转导通路层面进一步探讨其对运动疲劳的神经生物学机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组

雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，7周龄，清洁级，体重（189.2±16.7）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。适应性饲养1周后，以20 min/d的运动量筛选大鼠，将不适应跑台训练的淘汰，剩余的随机分为对照组、大强度运动组和中药组，每组10只。

1.2 运动模型的建立

对照组不进行任何运动训练，大强度运动组和中药组在小动物跑台上进行跑台训练。采用的运动方案参考 Bedford[4]和Wisloff[5]的递增负荷跑台运动（并略加修改），时间为7周（具体方案见表1）。力竭标准为：大鼠不能保持预定速度，3次以上滞留于跑道后1/3处，刺激驱赶无效。行为特点表现为神精倦怠、呼吸深大，俯卧位，对刺激反应不明显。

3 讨论

3.1 长期大强度运动对大鼠海马神经元凋亡的影响

细胞凋亡是是一种受基因调控的程序性死亡[6]，是机体维持自身稳定和适应环境必需的生理过程[7]。运动引起机体的细胞凋亡作为组织的一种自我保护机制，能够完成组织更新、细胞替换和清除损伤等正常的生理过程。而不适当地或过度地细胞凋亡则会造成组织器官、系统功能失调与障碍，是引发运动疲劳的可能机制之一。过度或长时间力竭运动的应激反应会导致大脑的缺血缺氧，能量代谢障碍、兴奋性氨基酸、氧自由基、一氧化氮等释放增加，细胞内钙超载，炎性细胞聚集，导致原癌基因和促凋亡蛋白的表达，启动凋亡程序[8]。本研究用TUNEL 方法来观察长期大强度训练对大鼠海马神经元凋亡的影响，结果发现，对照组只有少量的凋亡细胞（3.12±0.67），大强度运动组的大鼠海马神经元凋亡细胞数明显高于对照组（15.38±3.56），具有显著性差异（P<0.01）。由此可见，长期大强度运动可能通过诱导大鼠海马的细胞凋亡引起神经系统功能失调与障碍，这可能是运动疲劳的中枢机制之一。

3.2 长期大强度运动对JAK/STAT信号通路的影响

JAKs 激酶（ Janus kinase，JAKs）及信号转导和转录激活因子（ signal transducer andactivator of transcription，STATs） 信号转导系统是一条广泛存在于组织中的、完整的信号转导途径，对细胞的生长、活化和凋亡等生理功能起重要的调节作用，是Darnell J E Jr等在研究干扰素（IFN）对细胞基因转录诱导的作用时发现的。细胞膜上的信号可以通过JAK/STAT信号转导系统直接传递到细胞核内并启动基因转录，作用直接并且传递速度快，其转导过程大致如下：细胞外信号识别并结合细胞膜上的细胞因子受体，诱导受体聚化形成二聚体或三聚体，在胞浆内形成高亲和性JAKs结合位点，与JAKs结合，并发生酪氨酸磷酸化而活化，活化后的JAKs进一步募集胞浆内相应的信号转导和STATs，并使其一个羟基酪氨酸磷酸化而活化，活化后的STATs与受体亲和力降低，与受体分离，形成二聚体并转移到核内，与目的基因的特定反应元件相结合，诱导目的基因表达，促进多种蛋白质的合成，完成细胞因子受体介导的信号传导过程，从而发挥细胞因子的多种生物学效因[9]。JAK/STAT信号途径广泛参与了多种细胞因子的信号转导过程，如白介素-2、4、6（IL-2、4、6）、集落刺激因子（CSF）、生长激素等，通过调控该因子的细胞分化、增殖和凋亡等生理过程，实现免疫调节、生成造血细胞、神经和胚胎发育等多种生物学功能[10]。JAK/STAT 信号转导途径对缺血后神经细胞的存亡有非常重要的意义，能够调控脑缺血引起的细胞凋亡，JAK1/STAT1 信号转导途径是其中的一条重要路径，与神经细胞凋亡的关系较为密切。大量研究表明，STAT1在通过发挥促凋亡作用，参与脑缺血的神经元损伤。West等[11]在对脑缺血再灌注损伤大鼠的研究中发现，局灶性脑缺血可以通过促进STAT1的表达，诱导神经细胞的凋亡。李文涛等[12]发现慢性脑缺血大鼠STAT1蛋白在大脑皮层和海马的阳性细胞数明显多于非缺血大鼠，差异有统计学意义（P<0.05），并由此推论，STAT1可能参与慢性脑缺血大鼠神经细胞死亡的诱导。此外，STAT1还可以促进Casepase-3、Casepase-7、Casepase-9等的表达。Stephanou等[13]发现STAT1还可以通过抑制脑缺血再灌注损伤后抗凋亡基因Bcl-x及Bcl-2的活化和表达，发挥促凋亡作用。以上研究结果表明，STAT1可能处于信号通路级联反应的中心环节，通过调控其下游的众多凋亡相关基因的表达促进凋亡发生，参与脑缺血损伤。Casepase-3 是 Caspase家族中的重要成员，是哺乳动物凋亡程序中的关键蛋白酶，是凋亡级联反应通路上的核心调控因子，故被称为死亡蛋白酶[14]。Caspase-3 是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路，是凋亡的关键酶和执行者，在凋亡程序中起最后的枢纽作用[15]。

为了探讨长期大强度运动引起的脑缺血是否可激活JAK1/STAT1信号转导通路，参与脑缺血的病理生理过程，我们建立了长期大强度运动模型，观察大强度运动组p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3蛋白表达水平的变化。结果发现，大强度运动组p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3蛋白表达水平均较对照组显著升高，并且细胞凋亡水平也显著高于对照组。因此我们推测，长期大强度运动导致的脑缺血能引起大量细胞因子和生长因子的释放，可能激活JAK1/STAT1信号通路，通过调节与凋亡相关蛋白Caspase-3等的转录与磷酸化和其他途径参与了缺血性脑损伤的过程，发挥了其促凋亡作用。

3.3 益气养血补肾方对细胞凋亡及JAK/STAT信号通路的影响

我国传统的中医药注重辩证施治，在抗运动疲劳方面具有显著的优势。长期大强度运动引起的运动疲劳属于中医“劳倦”、“虚劳”的范畴。中医理论认为，肾藏精，主骨、生髓，为先天之本，脑为髓海。劳则伤肾，因此长期大强度运动可致肾精不足，髓海空虚。气血是人体最基本的生命物质，脑离不开气血的温煦、儒养。劳则耗伤气血等精微物质，肾精不足不能化生气血，都可导致气血亏虚，脑失濡养，引起缺血性脑损伤等病理生理过程。由此可见，长期大强度运动后引起的肾精不足，气血亏虚是运动疲劳的主要病因病机。为此，本研究选用复方中药益气养血补肾方进行干预，旨在探讨该方对运动疲劳的神经生物学机制，从而为该方药延缓或消除运动疲劳提供分子水平的理论依据。益气养血补肾方由八珍汤和肉桂、补骨脂等14味中药组成，共奏补肾益精、气血双补之效。

本研究结果表明，中药组的细胞凋亡水平及p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3蛋白表达水平较大强度运动组均显著降低（P<0.05，P<0.01）。因此说明，复方中药益气养血补肾方可能通过抑制p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的过度表达发挥抗凋亡作用，从而减轻缺血性脑损伤，达到神经保护作用。

综上所述，长期大强度运动导致的脑缺血可能引起p-JAK1、p-STAT1、Casepase-3的过度表达，激活JAK1/STAT1信号通路，并发挥促凋亡作用，说明JAK1/STAT1信号转导途径可能参与了脑缺血损伤后的病理生理过程，但JAK1/STAT1信号转导途径在长期大强度运动导致的脑缺血损伤中的具体作用机制尚未完全阐明，仍需进一步研究。复方中药益气养血补肾方可能通过抑制p-JAK1、p-STAT1和Casepase-3的过度表达发挥抗凋亡作用，减轻缺血性脑损伤，从而达到神经保护作用。

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