细胞代谢组学用于木犀草素抑制MCF7细胞的机制研究

史栋栋等

摘要基于气相色谱质谱联用（GCMS）技术将代谢组学的方法结合细胞周期的实验，研究木犀草素作用于MCF7细胞的作用机理。细胞活性实验验证， 木犀草素对MCF7细胞有抑制作用，GCTOF/MS对加药细胞和未加药细胞代谢物进行指纹图谱分析，并进一步应用偏最小二乘判别分析（OPLSDA）对代谢组学数据进行多维统计分析。结合木犀草素将细胞周期抑制在S期（Synthesis），推测木犀草素通过阻碍核酸代谢中的磷酸戊糖途径抑制MCF7细胞的增殖。

关键词气相色谱质谱联用； 细胞代谢组学； MCF7 细胞； 细胞周期； 乳腺癌； 木犀草素

1引言

细胞代谢组学是以肿瘤细胞作为代谢组学研究对象，通过体内体外因素的作用，对生物体内代谢物的变化进行定量分析，寻找代谢物类型和数量变化与生理及病理变化的相互关系和动态规律＼[1＼]。用代谢组学的方法研究中药活性物质引起的内源性代谢物的变化，发现潜在的生物代谢差异物，阐明药物的作用机制，具有独特的优势＼[2＼]。

素作用于乳腺癌MCF7细胞的机理进行深入研究，从代谢组学的角度为木犀草素的抗肿瘤机制提供新的线索。

2实验部分

21仪器与试剂

FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；CO2培养箱、全自动酶标分析仪（美国Thermo公司）；PEGASUS 4D GC×GCTOFMS（美国LECO公司）；LNGT88台式快速离心浓缩干燥器（太仓市华美生化仪器厂）；L35低温冷阱（太仓市华美生化仪器厂）；XW80A漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；96孔培养板（丹麦Nunc公司）。

胎牛血清（美国Gibco公司），DMEM/HIGH GLUCOSE DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶（赛默飞世尔生物化学制品有限公司（北京））；四甲基偶氮唑盐（MTT）、碘化丙啶（PI）、RNaseA酶、甲氧胺、2氯苯丙氨酸（Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（HPLC级，德国Merck公司）；吡啶（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硅烷化试剂BSTFA（含1%三甲基氯硅烷TMCS）。人乳腺癌细胞MCF7购于中国科学院上海细胞库。

22MTT实验测药物对细胞增殖的影响

MCF7细胞培养，传3代后，取对数生长期细胞，加入025%胰蛋白酶浸润所有细胞表面后，吸出，于5% CO2培养箱中37 ℃消化3～5 min。加入3 mL含血清培养基终止消化后，接种于96孔板，每孔100 μL（3×103～4×103个cell/孔）。培养12 h后，加药，药物浓度梯度为： 10， 25， 50， 100和200 mg/L。每孔5个平行。设置时间梯度为24，48和72 h，分别考察药物浓度和作用 时间对细胞增殖的影响。

25数据统计方式

将GCMS获得的所有原始质谱数据通过ChromaTOF软件（v330， Leco Co， CA， USA）转化成CDF格式，然后用ChromaTOF软件对数据进行峰识别、峰对齐、基线矫正、峰面积归一化预处理。导入SIMCAP 115 软件进行多维分析。在本实验中采用OPLSDA模型区别各组代谢物差异。结合评价OPLSDA模型质量的3个关键指标（R2X，表示模型概括X矩阵结实率；R2Y，反应建模稳定性；Q2Y反应模型预测性；其中R2Y和Q2Y越接近1，说明模型稳定性和预测性越好）。根据OPLSDA模型得到的变量权重值（Variable importance in the projection， VIP）找到潜在的代谢差异物，VIP>1。实验中采用了t检验，验证多维统计中得到的差异物是否具有显著差异。搜索数据库为NIST数据库。

为得到更多的代谢产物，必须将细胞破壁，将产物得以释放，才能进一步提取。因此，细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤＼[7＼]。本实验采用超声破碎的方法，对超声时间进行了优化。最后采取3 min，5 s开，5 s关进行超声，在这个时间内既可以提取到多的细胞代谢物，又不会因产热太多导致代谢物发生变化。

33基于GCTOF/MS技术的木犀草素作用于MCF7细胞后的代谢组学分析

基于细胞代谢组学中细胞代谢物的考察均是在活细胞的基础之上，综合考虑羽扇豆醇对MCF7细胞的抑制作用，最终的作用浓度为50 mg/L，作用时间24 h。GCMS优良的定性和定量分析能力，加上其庞大的化合物谱库，为鉴定工作带来了很大便利，使其在代谢组学研究中具有突出优势＼[8，9＼]。图2为典型的MCF7细胞的GCTOF/MS代谢物谱图，在S/N=10时，MCF7细胞的代谢谱图分子特征峰个数在500～600之间。

MCF7细胞分别用木犀草素作用6， 12和24 h后，在上述优化的色谱条件下，分别对细胞样品进行分析，采集GCTOF/MS数据并进行多维统计处理。

在上述通过代谢组学发现的差异物中，DRibose的代谢与磷酸戊糖代谢途径（Pentose phosphate pathway）有关。磷酸戊糖途径生成具有重要生理功能的5磷酸核糖（DRibose5phosphate）和NADPH＼[12＼]。具体为磷酸戊糖途径以6磷酸葡萄糖开始，经过葡糖6磷酸脱氢酶、葡萄糖内酯水解酶、6磷酸葡萄糖酸脱氢酶的催化下生成5磷酸核酮糖，5磷酸核酮酶可以在5磷酸异构酶的作用下生成5磷酸核糖，5磷酸核糖为核酸和核苷酸的合成提供核糖基团。DRibose的含量下降，说明其来源5磷酸核糖的含量也有所下降，从而使得合成核酸和核苷酸的原料减少，抑制了S期DNA的复制。

最直接联系核苷酸合成和糖代谢的物质是1磷酸葡萄糖，1磷酸葡萄糖可以在磷酸异构酶的作用下生成6磷酸葡萄糖，从而进行核酸的合成。核酸的合成途径受到阻滞，导致大量1磷酸葡萄糖参与到糖代谢，使得DGalactose的含量大幅度生长。在核酸的酶促降解过程中会有磷酸生成，推测木犀草素抑制了核酸酶及其核酸苷酶的活性，从而使磷酸（Phosphoric Acid）的含量下降。

综合分析，核酸是承载物体遗传信息的构成细胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滞了核酸的代谢。

4结论

以GCMS联用技术为平台，通过多元统计分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7细胞后细胞代谢物的变化。结果表明，加药组和未加药组存在显著的差异，对具有显著性差异的物质进行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10种代谢差异物。结合木犀草素将MCF7细胞抑制在S期（主要进行DNA的复制）的细胞实验结果，推测木犀草素主要通过阻滞磷酸戊糖代谢途径中酶的活性来抑制细胞的增殖。

本研究利用代谢组学的方法研究中药活性物质作用于细胞的生物化学变化，并且与传统手段的测定结果相联系，为药物的机理研究提供了一种新的有效平台。

王洪燕， 全 康， 蒋燕灵， 吴加国， 唐修文 浙江大学学报， 2010， 39（1）： 30-36

6Sana T R， Waddell K， Fischer S M J Chromatogr B， 2008， 871： 314

7MendesPinto M M， Raposo M F J J App Phycol， 2001， 13： 19-24

8Lenz E M， Wilson I D Journal of Proteome Research， 2007， 6（2）： 443-458

9Jonsson P， Stenlund H， Moritz T， Trygg J， Sjstrm M， Verheij E R， Lindberg J， SchuppeKoistinen I， Antti H Metabolomics， 2006， 2（3）： 135-143

10Murray R K， Granner D K， Mayes P A Harpers hiochemistry， New York： McGraw Hill， 2000： 600-616

11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin

综合分析，核酸是承载物体遗传信息的构成细胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滞了核酸的代谢。

4结论

以GCMS联用技术为平台，通过多元统计分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7细胞后细胞代谢物的变化。结果表明，加药组和未加药组存在显著的差异，对具有显著性差异的物质进行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10种代谢差异物。结合木犀草素将MCF7细胞抑制在S期（主要进行DNA的复制）的细胞实验结果，推测木犀草素主要通过阻滞磷酸戊糖代谢途径中酶的活性来抑制细胞的增殖。

本研究利用代谢组学的方法研究中药活性物质作用于细胞的生物化学变化，并且与传统手段的测定结果相联系，为药物的机理研究提供了一种新的有效平台。

王洪燕， 全 康， 蒋燕灵， 吴加国， 唐修文 浙江大学学报， 2010， 39（1）： 30-36

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11Dumas M E， Barton R H， Toye A， Cloarec O， Blancher C， Rothwell A， Fearnside J， Tatoud R， Blanc V， Lindon J C， Mitchell S C， Holmes E， McCarthy M I， Scott J， Gauguier D， Nicholson J K Proc Natl Acal Sci USA， 2006， 103（33）： 12511-12516

12JIA Wei Medical Metabonomics Shanghai： Shanghai Science and Technique Publishing House， 2011： 78-83

AbstractThe metabolic profiles of control and MCF7 cells treated with luteolin were analyzed separately using gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS） to study the mechanism of the luteolin treatment on MCF7 cells Cell viability assays showed that luteolin had inhibition effect on MCF7 cells Partial least square discriminant analysis （OPLSDA） was used to process the metabolic data Since cells in phase of S were increased significantly， we speculated that luteolin had a blocking effect on pentose phosphate pathway of MCF7 cells， which contributed to its inhibition effect on proliferation of MCF7 cells

KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin

综合分析，核酸是承载物体遗传信息的构成细胞的最重要的成分。木犀草素可能主要阻滞了核酸的代谢。

4结论

以GCMS联用技术为平台，通过多元统计分析等手段探索了木犀草素作用后MCF7细胞后细胞代谢物的变化。结果表明，加药组和未加药组存在显著的差异，对具有显著性差异的物质进行分析，得到了DRibose、DGalactose和Phosphoric Acid等10种代谢差异物。结合木犀草素将MCF7细胞抑制在S期（主要进行DNA的复制）的细胞实验结果，推测木犀草素主要通过阻滞磷酸戊糖代谢途径中酶的活性来抑制细胞的增殖。

本研究利用代谢组学的方法研究中药活性物质作用于细胞的生物化学变化，并且与传统手段的测定结果相联系，为药物的机理研究提供了一种新的有效平台。

王洪燕， 全 康， 蒋燕灵， 吴加国， 唐修文 浙江大学学报， 2010， 39（1）： 30-36

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KeywordsGas chromatography/mass spectrometry； Cell metabonomics； MCF7 cells； Cell cycle； Breast cancer； Luteolin