玉米品种德美亚多重SSR-PCR系统的建立及应用

王超，马雪娜，冯博，郭春兰，李莹，侯文秀，邹冰雪，黄珊珊，化金阁，郭梅，杨楠，庞震

（1.北大荒垦丰种业股份有限公司/农业农村部作物生物育种重点实验室，哈尔滨 150431；2.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；3.东北农业大学农学院，哈尔滨 150038）

0 引言

玉米种子纯度的高低很大程度上决定了优良作物品种的增产潜力。目前，种子市场秩序比较混乱，在销售市场中严重存在以假冒真、以劣充优的现象，不仅侵害了农民和合法经营企业的权益，而且也严重阻碍了农业生产的发展。因此，纯度检验在作物种子生产、加工和流通中具有重要的意义和应用价值[1]。种子纯度的检验方法很多，其中DNA分子标记技术是能够直接反映生物个体或种群间基因组内具有差异性的DNA片段，并不受外界环境因素的影响，被越来越多的科研工作者使用[2-5]。目前，SSR（简单序列重复Simple Sequence Repeats）标记以其在基因组内的多态性丰富、检测技术简单、结果可靠、重复性好等优点，已被广泛应用于玉米种子真实性和纯度检测中[3，6-8]。

多重PCR 技术是在一个反应体系中加入多对反应引物，扩增出多个目的条带的技术。由于该技术具有快速高效、低成本等优点，目前在生物学的各个领域已得到广泛的应用[9-12]。因此本研究的主要目的在于利用SSR标记，针对本公司主推不同系列的‘德美亚’品种，筛选具有多态性的SSR 引物，并组建多重引物组合，将多重PCR技术应用到玉米种子纯度鉴定中，制定出一套玉米品种纯度鉴定方案，指导大田生产。

1 材料与方法

1.1 材料

选用本公司提供的‘德美亚’杂交种及其亲本为试验材料，‘德美亚’品种主要分为3 个系列，分别是‘德美亚1号’、‘德美亚2号’和‘德美亚3号’。

1.2 SSR引物

SSR引物来自本实验室，引物序列主要来自中华人民共和国农业行业标准NY/T 1432—2007上公布的玉米40对核心SSR引物，并由上海英俊生物技术有限公司北京部完成引物合成。

1.3 玉米基因组DNA的提取

本试验采用4 种基因组DNA 提取方法：CTAB 提取法（参考MURRAY 等[13]）、磁珠法、改良的SDS 提取法（96孔板提取）、碱煮法[14]。

1.3.1 CTAB提取法

取玉米叶片组织置于2.0 mL离心管中（离心管中装有5 mm 钢珠），用液氮研磨成粉末；加入800µL 预热到65 ℃的1×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液，放入65 ℃水浴锅中水浴30 min，期间颠倒混匀两次；然后加入等体积（800µL）的氯仿/异戊醇（24∶1），颠倒混匀1 min；12 000 r/min 离心15 min，取700µL 上清液转移至新的1.5 mL 离心管中；加入500µL预冷的异丙醇，颠倒混匀，可见絮状沉淀，用毛细管勾出絮状沉淀，轻轻转移至另一新的1.5 mL离心管中，加入200µL 70%的乙醇洗涤一次，尽量吸干管中的乙醇，将DNA在管中自然晾干，最后加入100µL的TE1.0（含有RNase）溶解DNA，4 ℃保存备用。

1.3.2 磁珠法

采用GOMagTMPlant DNA Kit，配套使用KingFisher Flex自动核酸提取仪。具体操作步骤试剂盒说明书有说明。

1.3.3 改良的SDS提取法

取玉米叶片组织置于96 孔板中（板中装有5 mm 钢珠），用压板机将盖子压紧后放置-80 ℃冰箱中2～3 h；用研磨仪研磨成粉末，每个孔中加入400 µL 的SDS 提取液，用压板机将盖子压紧后，在磨样机中磨样2 min；离心1 min，4 000 r/min，随后加入200µL NH4COOH，室温放置10～15 min；离心25～30 min，4 000 r/min，将400µL 上清转移至一新的96 孔板中，然后加入0.7 倍体积280µL 异丙醇，混匀，然后-20 ℃冰箱中放置15～30 min；离心15 min，4 000 r/min，小心将上清倒掉，然后加入300µL 70%乙醇；离心1 min，4 000 r/min，小心倒掉上清，吹干，加入100µL TE1.0（含有RNase）溶解DNA，4 ℃保存备用。

1.3.4 碱煮法

取玉米胚组织（挖胚）放在96孔深孔板中（板中装有5 mm 钢珠），加入0.1 mol/L NaOH 提取液250µL，以盖住样品为准，用封口膜封上深孔板，密封严实（避免水浴时水进入到样品中），水沸腾后煮沸15 min，水量要适宜。煮沸15 min 后，将样孔板拿出，擦干上面的水，揭下封口膜，擦干水，加入等体积250 µL TE 缓冲液（pH2.0），静置至室温备用。

1.4 DNA质量检测

提取的玉米基因组DNA 采用超微量分光光度计Nanodrop8000 检测其浓度，并用1%的琼脂糖凝胶检测基因组DNA 的质量。

1.5 PCR扩增

单重PCR 体系：20 ng DNA 1µL、10×Buffer 1µL、引物0.4µL、Taq 酶0.1µL、dNTP 0.2µL、ddH2O 7.3µL，总体积为10µL。

多重PCR 体系中，相应地增加引物对数，但是引物用量与单重PCR 体系中一致，为保证PCR 体系不变，相应地减少ddH2O 用量。

PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.6 琼脂糖凝胶电泳检测

多重PCR扩增产物采用4%琼脂糖凝胶电泳检测，恒压160 V 电泳1 h，用凝胶成像仪扫描结果并记录。

1.7 SSR引物多态性筛选

将40对SSR 引物分别对‘德美亚1 号’、‘德美亚2号’和‘德美亚3 号’的父本和母本进行多态性筛选，一共是6 个样品，选用父母本质量较好的DNA 进行引物多态性筛选，筛选双亲之间片段大小有明显差异的，并且用4%琼脂糖凝胶检测能够明显看出差异的及扩增稳定的最适合引物，为后续组建多重引物组合做准备。

2 结果与分析

2.1 不同DNA提取方法的比较

不同方法提取的玉米基因组DNA 浓度结果见表1。不同提取方法得到的玉米基因组DNA 质量存在一定的差异，通过Nanodrop 测定DNA 浓度结果显示CTAB 法和SDS 法提取的样品A260/A280 比值在2.0 左右，磁珠法提取的样品A260/A280比值在1.9左右，但是前两者方法提取的DNA 产量很高，所提DNA 浓度是磁珠法所提DNA 浓度的2倍左右；而碱煮法提取的样品A260/A280 比值较差，DNA 浓度也偏低，说明此方法提取的DNA中含有较多杂质。

表1 不同方法提取的玉米基因组DNA 的紫外检测结果Table 1 The UV test results of maize genome DNA with different extraction methods

将玉米基因组DNA 用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果（图1）显示CTAB、SDS和磁珠法所提的DNA带型清晰明亮，说明所提的DNA含量较高，主带完整，条带无严重拖尾现象，说明DNA基本上没有降解；胶孔内干净，说明没有其他杂质的成分。相反，碱煮法所提取的DNA 在胶图中没有看到主带，说明此方法提取的DNA浓度极低，质量差。

图1 4种方法提取的玉米基因组DNA质量比较Fig.1 Comparison of DNA quality of maize genome using the four extraction methods

4 种方法提取的DNA 进行PCR 扩增时，用一对引物进行扩增时，扩增效果都比较好，彼此之间没有太大的差异；用多对引物同时进行扩增时，CTAB 法、磁珠法和SDS法都能得到很好的扩增效果，扩增产物带型清晰，条带大小一致，但是碱煮法提取的DNA扩增效果差，扩增产物带型呈现弥散状态，不稳定。比较这4种方法的优缺点，CTAB法虽然提取的DNA 质量高、量大，但是步骤繁琐，并且存在有毒试剂（甲醛）；磁珠法提取DNA 质量好但成本太高；碱煮法前期挖胚工作耗费时间且DNA扩增效果不好；SDS法提取DNA 质量好，步骤相对简单，且有害试剂少，更适合对于纯度鉴定这种大样本的DNA 提取，综上所述，为了节省时间和降低成本，我们选用SDS法进行后续的样本DNA提取工作。

2.2 SSR引物多态性筛选的确定

利用公布的40对玉米SSR引物分别对‘德美亚1号’、‘德美亚2号’和‘德美亚3号’的亲本及F1进行引物多态性初步筛选，将每一个引物位点都对母本、父本和F1进行PCR 扩增，并通过4%琼脂糖凝胶电泳检测。初步筛选结果：‘德美亚1号’亲本之间筛选出16对引物，‘德美亚2号’亲本之间筛选出23对引物，‘德美亚3号’亲本之间筛选出21对引物。随后将初步筛选出的这些引物进行复筛再次验证，根据复筛的结果，我们选择亲本之间扩增产物条带大小差异较大，并且扩增稳定，没有非特异性扩增的优秀引物。最终，‘德美亚1号’筛选出5 对引物分别是：P01、P05、P10、P12 和P37；‘德美亚2 号’筛选出9 对引物分别是：P06、P11、P13、P21、P25、P30、P33、P37 和P40；‘德美亚3 号’筛选出9 对引物分别是：P08、P12、P13、P14、P22、P30、P34、P37和P40。引物多态性筛选电泳结果见图2、图3和图4。

图2 德美亚1号引物多态性复筛结果Fig.2 The results of the second selection of primer polymorphism in Demeiya1

图3 德美亚2号引物多态性复筛结果Fig.3 The results of the second selection of primer polymorphism in Demeiya2

图4 德美亚3号引物复筛电泳结果Fig.4 The results of the second selection of primer polymorphism in Demeiya3

2.3 多重引物组合的设计与筛选

我们利用前期引物多态性筛选的结果，将‘德美亚’不同系列所筛选到的引物进行毛细管电泳（QIAxcel Advanced），进而能够具体得到每对引物扩增产物片段的大小，然后根据片段大小进行多重引物的组合，这样既可以避免出现扩增片段重合的现象，又能缩短筛选时间，提高工作效率。

2.3.1 3重PCR扩增

对于杂交种而言，每一对引物可以产生两条谱带，引物数量越多，扩增的谱带数也会越多，很容易出现谱带之间重叠或者距离相近的现象，再加上琼脂糖凝胶的分辨率有限，所以需要进行组合的引物数量不能太多，同时需要考虑引物在染色体上的位置，选择位于不同染色体上的引物进行组合。因此我们主要进行了3重引物的组合：‘德美亚1号’杂交种设计了3组3重引物组合，并命名为1-1、1-2和1-3；‘德美亚2号’杂交种设计了13组3重引物组合，并命名为2-1、2-2、2-3……2-13；‘德美亚3号’杂交种设计了10组3重引物组合，并命名为3-1、3-2、3-3……3-10。‘德美亚’不同系列3重引物组合设计见表2。

表2 德美亚1、2、3 号3 重引物组合汇总Table 2 Three-fold primer group from Demeiya1,2 and 3

为了进一步鉴定多重引物组合的扩增效果，我们选择用CTAB法提取的DNA作为模板，同时将设计好的3 重引物组合分别对母本、父本和杂交种进行PCR 扩增，两次重复，即分别将3 对引物依次加入到同一PCR管中，所用试剂用量和DNA 模板用量均与单重PCR 相同，PCR 体系为10µL，扩增程序也与单重PCR 相同，PCR扩增结束后，用4%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。多重扩增凝胶电泳分离效果见图5。

图5 德美亚1号、2号、3号3重引物组合凝胶扩增效果Fig.5 The amplification results of primer by three-fold PCR in Demeiya1,Demeiya2 and Demeiya3

从结果中可以看出，‘德美亚1 号’3个组合扩增效果并不是很理想，组合1-1 中引物P10 扩增效率太低，无论在亲本和杂交种中，P10 扩增条带都偏弱，这可能是引物之间存在竞争性抑制作用导致。后期我们将P10引物进行优化，但是效果并不明显。组合1-2中引物P12的父本带与P01的父本带重合，难以分辨，所以导致在父本中我们只看到两条带，而在杂交种中，我们只看到5条带。组合1-3的问题与组合1-2是一样的。所以最后我们采用P01和P37进行两重PCR扩增，扩增效果非常好，条带清晰并且能够区分开。

针对于‘德美亚2 号’，经过第一次筛选，我们从13个组合中筛选到了9 个扩增效果好的组合：2-1、2-2、2-5、2-6、2-7、2-8、2-11、2-12、2-13；经过第二次筛选，进而从这9个组合中我们最终选择5个扩增效果更好的组合：2-1、2-7、2-8、2-12 和2-13。针对于‘德美亚3 号’，我们从10 个组合中筛选到了5 个扩增效果较好的组合：3-1、3-3、3-5、3-7、3-10。

每一个组合的3 对引物在亲本和杂交种中都能扩增出清晰的条带，在亲本中表现出3 条带，在杂交种中表现出6 条带，条带数量没有增加或减少，条带的位置也没有发生变化，并且条带之间能够区分开来。而剩余的其他组合扩增效果较差，扩增条带较弱，条带之间距离相近，难以分辨，同时3对引物中有的只扩增2对引物或者1对引物，组合引物扩增效率太低，引物之间存在很强的竞争性抑制作用，并且表现也不稳定。

2.3.2 4重和5重PCR扩增

对于自交系而言，每一对引物只能产生一条谱带，所以相比杂交种来说，引物数量可以相应地增加，因此我们在3重引物的基础上设计了4重、5重引物组合来鉴定不同的自交系。4重和5重的PCR扩增体系同3重一样，只是相应地增加了引物的数量，‘德美亚1 号’亲本采用4重引物组合（P01+P05+P12+P37）鉴定，‘德美亚2 号’亲本也采用4 重引物组合（P06+P37+P21+P30）鉴定，德美亚3 号亲本采用5 重引物组合（P08+P40+P12+P13+P37）鉴定，4重和5重都得到了很好的扩增效果，同时表明本试验所采用的扩增体系和扩增程序适宜2～5重PCR反应。自交系的多重引物PCR 扩增效果见图6。

图6 德美亚自交系4重或5重引物PCR扩增效果Fig.6 The amplification results of primer by four or five-fold PCR in Demeiya inbreds

2.4 多重PCR技术检测玉米杂交种纯度

我们利用所确定的3重引物组合进行‘德美亚1 号’、‘德美亚2号’和‘德美亚3号’杂交种种子纯度的鉴定，每份样品检测100个单株，并且用SDS法进行DNA 提取。‘德美亚1号’采用两重PCR+单重PCR 组合模式进行纯度鉴定，‘德美亚2号’选用组合2-1进行纯度鉴定，‘德美亚3号’所筛选的5个最优组合中都具有P30这个引物，而由于后期我们进行杂交种纯度鉴定时发现引物P30该位点表现极不稳定，在杂交种中该位点出现单带的比例很高，所以这个引物后续将不能用于杂交种纯度的检测，所以我们使用组合3-4（P08+P12+P13）来进行‘德美亚3号’杂交种纯度鉴定。部分样品杂交种纯度鉴定的结果见图7。

图7 多重PCR技术检测杂交种纯度Fig.7 Hybrid purity tested by multi-PCR technology

从图7 中可以看出，在‘德美亚1 号’杂交种纯度检测中，第1 号单株为杂株，引物P01 扩增出单带，而其他样品均扩增出正常的4 条带，并且带型表现一致。在‘德美亚2 号’杂交种纯度检测中，组合2-1 和组合2-13均能检测出杂种子，杂种子的带型不是来自本身父母本的结合，而是来自外源花粉的污染，其中组合2-13中的第10 号单株，3 对引物都扩增出单带，后经过分析，表明此单株属于母本自交苗。‘德美亚3号’杂交种纯度检测中，第15号单株表现异常带型，其他单株的带型均一致，该组合均能扩增出6条带，并且带型正常。

在玉米杂交种纯度检测中，采用多重引物PCR 技术检测不仅能够提高检测效率，节省成本，还能够显著提高检测的准确性。

3 讨论

3.1 玉米基因组DNA提取方法

DNA 是进行分子生物学研究的前提，DNA 质量的好坏直接决定了实验成败，因此获得高质量的DNA 对研究的成功起着至关重要的作用[15]。目前，植物DNA 提取方法主要有标准的CTAB 法、SDS法、碱煮法，而磁珠法用的较少，主要是该方法成本太高，对DNA 质量具有特定要求的试验才会采用。不同试验对于DNA 的质量要求也不同，本试验中只是进行纯度鉴定，所以无需将DNA 保存很久，由于纯度鉴定需要检测的单株样品量大，所以采用最少的试剂用量和简便的操作流程进行DNA 提取是最理想的[16-18]。在本试验4种DNA 提取方法中，快速碱煮法是最理想的DNA 提取方式，对于单重PCR 来说该方法效果较好，稳定性相对较高，但是对于多重PCR 来说其实并不理想，试验中杂交种3 重PCR 扩增条带未全部显示出来，无法对结果进行统计。综合考虑改进的SDS法是比较理想的DNA 提取方法，相对于CTAB和磁珠法，操作简便，有毒试剂少，并且成本较低，完全能够满足试验的需求。

3.2 多重PCR 技术在玉米品种纯度鉴定上的应用价值

多重PCR 即在单重PCR 的基础上增加引物的数量，多对引物采用相同的退火温度和退火时间，便于构建多重引物组合，引物之间可能竞争但所组建的引物组合均保证各个引物成功扩增[19]。相比于单重PCR，多重PCR 不仅能够减少试剂和样本的用量，同时也大大节省了人力和时间。王伟等研究玉米SSR 标记的多重PCR中指出利用多重PCR技术能够使工作效率提高2～6倍[20]。

目前，已经报道了很多关于SSR 标记多重PCR 技术检测品种纯度的研究[7，11，21-23]。谭君等利用多重PCR技术鉴定玉米品种研究中，以3 个玉米自交系和4 个杂交种为材料，成功构建了2～5 重引物组合，并有效应用于玉米种子纯度鉴定中[24]。吴明生等利用3 重PCR 检测玉米杂交种纯度，结果表明多重PCR 扩增效果非常理想，很容易将杂种子鉴别出来[25]。而在本研究中，针对玉米杂交种，我们也同样采用3 重引物组合的方法，扩增效果非常好，组合中的每一对引物都得到成功扩增，目的条带清晰。

玉米杂交种纯度主要是受母本去雄不及时或不彻底导致自交苗产生，以及外源花粉污染形成异型株，或者机械混杂的影响，其中母本自交苗是玉米杂交种纯度鉴定的关键，为了准确地将自交苗种子和杂种子鉴别出来，至少需要3 对引物，得到的结果才是可靠的。因此，我们构建3重引物组合可以满足纯度鉴定的要求。针对玉米自交系，我们也尝试了4 重和5 重引物组合，能够明显区分不同的自交系，都得到了很好的扩增效果。利用筛选出的这几套多重引物组合，可以有效应用到生产上大面积推广的玉米杂交种纯度的检测，确保鉴定结果可靠、高效、快速和低成本。

4 结论

本试验成功地构建了‘德美亚’系列玉米品种的特定纯度鉴定引物组合，‘德美亚1号’亲本采用4重引物组合（P01+P05+P12+P37）鉴定，‘德美亚2号’亲本也采用4重引物组合（P06+P37+P21+P30）鉴定，德美亚3号亲本采用5 重引物组合（P08+P40+P12+P13+P37）鉴定，4 重和5 重都得到了很好的扩增效果，同时表明本试验所采用的扩增体系和扩增程序适宜2～5重PCR反应。为今后‘德美亚’系列品种鉴定提供了便利，同时也为其他玉米品种的纯度鉴定提供了思路。