Aβ25～35诱导SH-SY5Y细胞阿尔茨海默病模型的建立及鹿茸多肽对其治疗作用

张春梅 张海燕,2 刘忠锦 袁齐宏 陈春荣

(1齐齐哈尔医学院附属第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161042；2齐齐哈尔医学院)

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄相关的渐行性神经类退行性疾病〔1〕。临床上以执行功能障碍、失认、失用、失语、记忆障碍等表现为主要特征〔2,3〕。其最初表现为获得性知识丧失、进行性记忆力减退〔4〕，最终可发展为完全丧失日常生活的活动能力〔5〕，给社会和家庭带来沉重负担,但是AD的病因迄今为止未明确〔6〕。

鹿茸是雄鹿未发生骨化的密生茸毛触角，其中包括马鹿和梅花鹿〔7〕。鹿茸属于珍贵的药材，其主要功效是益精补血、强筋健骨及温肾壮阳等。鹿茸含有大量的氨基酸、脂类物质、糖类化合物、无机盐及蛋白质〔8,9〕。其中糖类及蛋白类是研究较多的成分。目前，研究学者们对鹿茸的药理研究尚未针对确切的活性成分，仍停留在获得粗提物的提取阶段〔10,11〕。有研究推测鹿茸的生物学功能主要由蛋白质决定〔12〕。多肽类化合物在生命进程中扮演十分重要的作用〔13〕，本研究探讨鹿茸多肽(VAP)32对AD的治疗作用。

1 材料与方法

1.1细胞及试剂 SH-SY5Y细胞系购自美国ATCC细胞库；鼠抗人BACE1与ADAM10单克隆一抗均购自美国CST公司；相应二抗购自碧云天公司；双抗、DMEM和磷酸盐缓冲液(PBS)等试剂均购自天津标准科技有限公司；p-JNK基因的相关引物设计购自天津赛默飞公司。

1.2SH-SY5Y培养 细胞培养箱的培养温度为37℃,CO2浓度为5%。培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养基,并在培养基中加入双抗。显微镜下观察，当细胞达到视野下的80%～90%时，进行传代。大概2 d传代1次。传代时吸除培养基，并用Hanks液冲洗1次，之后用1 ml胰酶进行消化1 min，后用细胞培养液再清洗1次，然后加入1 ml培养基将贴壁细胞吹吸下来，将细胞以1传2或1传3置于培养瓶中，放入培养箱培养。

1.3Aβ25～35诱导SH-SY5Y细胞构建AD模型 将细胞随机分为正常(NOR)组、诱导(MOD)组及VAP32组。以Aβ25～35(4.0 μg/ml)诱导损伤SH-SY5Y细胞，之后四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力，作为MOD组。以VAP32作用被染毒的SH-SY5Y细胞作为多肽给药组，后用试剂盒测定各组细胞内丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活力及细胞凋亡情况。

1.4VAP32的提取纯化 以鹿茸为原料，小心去掉鹿角的绒毛，把鹿角锯成碎片，再把其研磨为颗粒。以水为溶剂，将超声提取与乙醇沉淀相结合。采用考马斯亮蓝法检测蛋白含量，固液比(1∶10)，提取3次，30 min/次。水提后醇沉VAP，乙醇浓度为65%，沉淀4 h。后用三聚氰胺凝胶电泳分析显示9条高分辨率条带。然后用不同的MFL-B膜(PP-100、PS-50、HPS10、HPS-5、HPS-3)在不同浓度溶液中分离纯化不同分子量的VAP。选择分子量为3.2 kD的多肽。最后冷冻干燥。收集冻干粉。

1.5RT-聚合酶链反应(PCR)测定基因表达量 使用软件设计β-actin和SATB2上下游引物序列，选取长度小于150 bp的片段。RNA提取：将各组细胞加入吹吸到离心管后，加入Trizol试剂，离心后取上清，加入氯仿继续离心取上清，之后加入异丙醇，弃掉上清取沉淀，后用DEPC水溶解，于PCR扩增仪中扩增。上样：将50×TAE 稀释为1× TAE 溶液作为溶剂，称取0.48 g琼脂糖，加入到1×TAE溶液中。微波炉加热煮沸后加入5 μl的核酸染料，摇晃混匀。最后将琼脂糖凝胶水平放入电泳槽，依次加入4 μl DNA Maker 及目的基因 PCR 扩增产物。P-JNK：上游引物序列：5′-CCACCTAGTAGTGTGATAGA-3′，下游引物序列：5′-ACGTCGCTAGAAGGACTGG-3′；β-actin上游引物序列：5′-CGATACGTCAGTAGCAATGG-3′，下游引物序列：5′-GGTCGACGTCTGCAGCAACA-3′。

1.6Western印迹测定蛋白含量 4℃ PBS洗涤各组细胞2～3次，收集后10 000 r/min离心，离心后移去上清液加入10 ml放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)冰上裂解15 min后离心15 min取上清。用考马斯法检测各管吸光值，将各组蛋白浓度调至同样后进行蛋白上样。上样条件为：80 V，30 min；120 V，30 min。转膜后，对应marker收集不同分子量的NC膜，把NC膜放入到预先标记好的平皿后，再添加脱脂奶粉并在摇床暗处封闭1 h。弃去奶粉后取出NC膜置于PBST中冲洗3次后，从左至右加入1 ml经1∶1 000倍数PBS稀释的鼠抗人BACE1与ADAM10一抗，于4℃下孵育过夜。第2天取出NC膜，于TBST溶液中洗涤4次后加入1∶1 000倍稀释的鼠抗兔2抗溶液孵育1 h后于TBST溶液中洗涤4次。最后配制发光液1.5 ml,a液和b液按1∶1的比例现用现配，由左至右缓慢滴加到膜上，每个膜滴加150 μl发光液，后转移到暗室进行胶片冲洗。

1.7统计学方法 采用SPSS20.1软件进行t检验、Pearson相关分析、χ2检验。

2 结 果

2.1不同浓度VAP32对细胞活力的影响 0、50、100、200 μg/ml VAP32加入后，随着培养时间的延长，细胞的活力〔(91.28±2.47)%、(90.64±4.53)%、(88.29±3.58)%、(87.65±5.27)%〕略有变化，但差异无统计学意义(P>0.05)。表明VAP32对SH-SY5Y细胞无毒性。

2.2不同浓度VAP32对细胞凋亡率的影响 3组细胞凋亡率随时间的延长，均显著升高(均P<0.05)。同一时间点，MOD组细胞凋亡率均显著高于NOR组和VAP32组(均P<0.05)。见表1。表明VAP32对AD模型细胞的凋亡有保护作用。

表1 各组细胞凋亡率比较

2.3各组细胞SOD、MDA水平比较 与NOR组比较，MOD组SOD水平显著下降，而MDA水平显著上升(均P<0.05)。与MOD组比较，VAP32组SOD水平显著上升，而MDA水平显著下降(均P<0.05)。见表2。表明VAP32能抑制Aβ25～35诱导SH-SY5Y细胞SOD及MDA变化，减少氧化应激损伤。

表2 各组氧自由基水平比较

2.4各组p-JNK基因表达水平比较 与NOR组、p-JNK基因表达水平(0.23±0.01)比较，MOD组(1.00±0.04)显著升高(P<0.05)，与MOD组比较，VAP32组(0.59±0.02)显著下降(P<0.05)。见图1。表明JNK通路参与Aβ25～35诱导的AD。而VAP32可抑制这一诱导。

2.5各组BACE1和ADAM10蛋白表达水平比较 与NOR组BACE1表达水平比较，MOD组显著升高，与MOD组比较，VAP32组显著下降(P<0.05)。与NOR组ADAM10表达水平比较，MOD组显著下降，与MOD组比较，VAP32组显著升高(P<0.05)。见表3，图2。

图1 Western印迹检测p-JNK基因表达

表3 各组BACE1和ADAM10 蛋白表达水平比较

图2 Western印迹检测细胞中BACE1和 ADAM10蛋白表达情况

3 讨 论

AD属于神经性的疾病，是由血管或神经损害引起社会适应能力的降低，是持续性的神经活动功能障碍。AD会影响患者思维记忆及分析判断能力，严重影响老年患者身心健康〔14〕。据统计，目前国际上AD患者已超过3 500万，且患病人数直线升高〔15〕。AD患者常见的病理特征是脑神经的细胞外会形成老年斑(淀粉样蛋白斑块)，而Aβ的含量常与AD严重程度相关〔16〕。

鹿茸中含有大量的功效成分，而多肽又是其比重比较大的组分，以往的多肽类研究都集中在多肽的混合物上，而对纯品多肽的研究较少〔17〕，本研究纯化出分子量为32 kD的单一多肽，发现其具有很强的AD抑制作用，这在国内外研究中较为少见，此外本研究发现VAP32可减少Aβ25～35诱导SH-SY5Y细胞内MDA的产生，提高细胞内SOD酶的活性。原因可能是AD早期神经元斑块在形成时，稳定性较差，容易被水解，刺激神经元发生氧化应激。研究证实，AD患者的大脑中会存在大量磷酸化的JNK，JNK被证实与APP的磷酸化有关，参与水解淀粉样蛋白Aβ通路〔18〕。另一方面，JNK可调节BACE1的表达水平，持续产生Aβ，从而促进淀粉样斑块持续的形成，而这一过程对AD患者来说无疑是致命的〔19〕。报道显示，AD在 BACE1蛋白表达升高的同时，常会伴随ADAM10蛋白表达水平降低〔20〕，由于BACE1与ADAM10蛋白会存在对共同底物的竞争结合关系，BACE1的表达降低，会通过负反馈调节机制反过来刺激ADAM10的表达，所以一旦JNK通路的激活被抑制，BACE1蛋白的表达会降低，而ADAM10蛋白的升高会同时被发现〔21〕。