基于网络药理学及分子对接探讨经典名方保元汤治疗慢性心力衰竭的作用机制

刁元元 邱智东 张宇航 石羽文 李军鸽 贾艾玲，2

(1长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2成都中医药大学药学院)

慢性心力衰竭(CHF)是心脏结构和功能的异常改变所导致，呼吸困难、身体疲乏和液体滞留是其表现形式，也是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段〔1〕。近些年，我国心血管疾病的发病率明显上升，心血管病占居民疾病死亡构成的40%以上，成为中国居民死亡的主要原因，因此心力衰竭已成为我国重大的公共卫生问题和解决心血管疾病的重大挑战〔2，3〕。现代医学已建立的CHF治疗是基于管理降低射血分数，包括药理学策略和非药理学策略，如心脏再同步治疗(CRT)装置或植入式心律转发器、除颤器(ICD)及生活方式的改变〔4〕。CHF康复专家共识指出〔5〕，通过运动进行规律的心脏康复，患者运动耐力可以得到明显改善，生活质量也明显提高。同时辅以中医药治疗，从整体观念入手，辨证论治，降低西药带来的不良反应，使CHF的治疗更加安全有效。

保元汤(BYD)名列《古代经典名方目录(第一批)》，收录于《简明医彀》(明·孙志宏)，其方为人参一钱，黄芪二钱，甘草五分，肉桂二分，又加生姜一片，水煎服〔6〕。在BYD中，人参和黄芪补益元气，甘草调和诸药，肉桂温通血脉，生姜温中助阳，全方补益元气，健脾护肺温肾，可治一切元气虚弱之证〔7〕。早期古籍记载，BYD主要治疗小儿痘疮类，历代医家广泛应用于元气虚弱的治疗，现今临床上常用保元汤加减方来治疗心血管系统、免疫系统、虚喘及妇产科等疾病〔8〕。CHF在中医角度属于气血不足，心力衰竭开始于心肺，以心为主，逐步累及肺、肝、脾、肾，作为补气方剂代表，BYD在治疗患者疾病过程中安全性高，副作用小，能有效改善心脏供血和心肌代谢功能，促进患者的康复〔9，10〕。

网络药理学是在系统层面结合网络信息数据库及相关计算机作图软件，将化合物-靶点-通路网络可视化的新兴综合学科，网络药理学与传统中医药相结合，与中医的“整体观”和“辨证施治”的原则相契合，同时与中药“多成分-多靶点-多途径”的系统网络分析相类似〔11，12〕。本研究通过网络药理学的方法系统阐述经典名方BYD治疗CHF的作用机制。

1 材料与方法

1.1BYD有效活性成分的收集与筛选 利用中药系统药理学分析平台TCMSP收集人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜的成分。根据口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18筛选活性成分，收集相应靶点，删除无明确作用靶点，得到活性成分。同时，提取其蛋白质靶点并将靶点蛋白信息标准化。

1.2CHF疾病相关靶点筛选 在人类基因数据库GeneCards中检索 “chronic heart failure”相关的疾病靶点，与BYD中收集到的靶点取交集后，最终获得BYD治疗CHF的潜在靶点。为明确BYD中活性成分靶点与 CHF 疾病靶点间的关系，获得BYD活性成分靶点与 CHF 靶点的交集基因。

1.3构建有效成分-疾病靶点网络 将BYD药材活性成分靶点与交集基因通过Cytoscape3.7.2软件构建活性成分-疾病靶点网络图，结合靶点度值对该网络进行可视化分析，明确药物、靶点与疾病的关系。

1.4构建交集基因蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析网络 PPI是一种用于寻找靶点间相互作用的途径。将交集基因导入STRING数据库，构建PPI网络图。

1.5KEGG和基因本体(GO)富集分析 通过DAVID数据库对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。将富集结果导入在线作图平台中进行可视化展示。

1.6分子对接分析 通过pubchem网站获取BYD中主要化合物槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇的SDF结构文件，利用Open Babel2.3.2软件将SDF文件转为PDB文件，从Protein Data Bank数据库中检索获得受体蛋白白细胞介素(IL)-6(PDBID： 1ALU)、肿瘤坏死因子(TNF，PDBID： 5MU8)、血管内皮生长因子(VEGF)A(PDBID： 4KZN)，利用PYMOL2.3.4软件和AutoDockTools软件对受体蛋白进行修饰。

2 结 果

2.1BYD活性成分筛选 在TCMSP中检索并筛选人参、黄芪、甘草、肉桂、生姜的有效成分，去除重复成分后，得到符合条件的活性成分133个。使用Uniprot数据库，将靶点名称转为基因名称，汇集总数，除去重复靶点后共获得潜在靶点144个。

2.2疾病靶点筛选 检索GeneCards数据库得到与 CHF 相关的靶点共9 382个，与BYD中的靶点取交集后，最终获得BYD治疗 CHF 的潜在靶点共140个。

2.3主要活性成分-疾病靶点网络分析 网络图中共包含296节点(其中药物节点5个，疾病节点1个，有效成分节点137个，靶点节点153个)，3 312条边。其中靶点对应黄色，药物有效成分对应绿色，BYD中的中药显示为粉色，疾病对应蓝色。根据网络可视化分析结果可知，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、异鼠李素等为度值较高的有效活性成分，见图1。

2.4PPI网络构建 将BYD中治疗CHF的140个靶点导入STRING数据库，隐藏断开的节点，得到PPI网络图，如图2，共涉及139个节点，1 433条边，平均节点数为20.6，平均局部聚类系数为0.521。度值排名前5的关键蛋白为IL-6、VEGFA、TNF、TP53、表皮生长因子(EGF)。

2.5GO分子功能富集结果与KEGG通路富集分析 GO富集分析得到184个GO条目(P<0.05，FDR<0.05)，生物过程(BP)条目119个、细胞成分(CC)条目24个、分子功能(MF)条目41个，各选取P值最小的前10个进行绘图呈现，结果显示，这些蛋白在生物过程方面主要涉及对药物的反应、细胞增殖的正调控、对乙醇的反应等过程；细胞组分方面主要参与细胞外间隙、质膜、突触后膜等过程；在分子功能方面主要参与酶结合、药物结合、类固醇激素受体、类固醇结合等过程，见图3。可推测出BYD在治疗CHF时可能与以上功能过程相关；KEGG通路富集分析得到112条通路(P<0.05，FDR<0.05)，主要有神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、癌症的途径、药物代谢-细胞色素P450、TNF信号通路、膀胱癌、cGMP-PKG信号通路等，富集分析结果前15的通路见表1。

图1 药物-有效成分-靶点网络

图2 BYD与CHF疾病PPI网络

图3 GO富集分析气泡

表1 KEGG通路富集分析排名前15的通路信息

续表1 KEGG通路富集分析排名前15的通路信息

2.6分子对接验证 选取BYD治疗CHF的主要活性成分槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇及PPI网络前3位核心靶点，利用PYMOL2.3.4软件和AutoDockTools软件进行分子对接和可视化处理。图4显示了受体蛋白IL-6、TNF、VEGFA与BYD中主要活性成分beta-sitosterol、Kaempferol、quercetin配体小分子之间的结合模式。结果显示结合能力良好，见表2。

图4 BYD主要活性成分与关键蛋白分子对接

表2 BYD治疗CHF核心成分与关键靶点的分子对接结果

3 讨 论

临床研究表明，中医药在CHF的心脏康复治疗中效果显著，BYD作为补益心气类的经方代表，在改善心脏舒张收缩功能、血流动力学方面及炎症因子方面均有显著作用〔13〕。

根据主要活性靶点网络图，BYD治疗CHF发挥作用的主要有效成分为黄芪和甘草中的槲皮素、刺芒柄花素和异鼠李素，人参、黄芪和甘草中含有的山奈酚、人参和生姜中的β-谷甾醇。槲皮素是人类饮食中常见的类黄酮类物质，在心血管系统保护方面有一定疗效，包括抗炎、抗氧化和血管舒张，研究发现槲皮素对于血管平滑肌具有多重抑制作用，通过转录因子(NF)-κB和AP-1抑制TNF-α诱导的人主动脉平滑肌(HASMC)增殖、G1～S期细胞周期进程和基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达〔14〕。槲皮素一般和糖结合，槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Q3GA) 是人体血浆中主要的槲皮素结合物之一，Q3GA能特异性抑制血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的血管平滑肌细胞JNK和AKT的激活及由此产生的细胞迁移和增殖，对AngⅡ诱导的平滑肌细胞(VSMC)肥大的预防作用部分归因于其对JNK和AP-1信号通路的抑制作用，在心血管预防方面有一定疗效〔15〕。山奈酚和刺芒柄花素两种成分相互协作，能抑制缺氧条件下H9c2心肌细胞内活性氧水平及NADPH氧化酶亚基NOX4、p67phox、p47phox表达量，调控氧化应激水平，达到防治 CHF 的目的〔16〕。β-谷甾醇通过诱导大鼠体内线粒体呼吸产生的活性氧促进细胞内谷胱甘肽氧化还原循环，此反应对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞凋亡具有保护作用〔17〕。研究表明β-谷甾醇通过介导PPARc/NF-κB信号通路的调节，达到对离体H/R诱导的心肌细胞损伤和载体心肌I/R损伤的保护作用〔18〕。异鼠李素是从中草药中提取的黄酮类活性化合物，通过激活磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路和诱导血红素加氧酶(HO)-1的产生达到抑制小鼠动脉粥样硬化斑块的形成，对动脉粥样硬化病症有良好治疗效果〔19〕。BYD中的这些主要成分在治疗CHF过程中可能发挥了主要作用。

通过PPI网络分析，筛选出BYD的核心靶点共有139个。包括IL-6、VEGFA、TNF、TP53、EGF等。IL-6是一种细胞因子，IL-6水平的缓慢升高会导致慢性炎症和纤维化，最新研究表明，短期IL-6信号可以保护心脏组织，长期过度产生的IL-6信号或IL6R蛋白在心血管疾病中起致病作用〔20〕。VEGFA是一种内皮细胞特异性有丝分裂原，在多种体内模型中也是血管生成的诱导剂，在生殖和骨血管生成时起到作用〔21〕。TNF-α拮抗剂目前成为治疗克罗恩病、类风湿关节炎和其他慢性全身炎症性疾病患者的有效疗法，特别是在心力衰竭的研究中，抗TNF-α水平对于心血管方面存在一定疗效〔22〕。TP53及其下游靶点TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子TIGAR对心脏代谢和细胞起到调节作用〔23〕。EGF是血管生成的核心因子，促进血管生成〔24〕。综上所述，在治疗CHF时，BYD可能通过调节关键靶点表达来达到疾病治疗效果。

KEGG富集分析涉及的通路有神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路等。通过对比冠状动脉旁路移植术(CABG)手术前后患者的心房样本的微阵列剖面数据分析可知，部分通过调节神经活性配体-受体相互作用的途径在术后的患者中对心脏保护起重要作用〔25〕。黄芪中的有效物质可改善失调的钙泵功能失调，达到对心肌细胞的一种保护作用〔26〕。在充血性心力衰竭兔中作用于心室肌细胞内Ca2+超载和钙振荡的机制能明显减弱兔的心脏功能和电重构严重发生〔27〕。

综上，BYD中主要化学成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、异鼠李素等主要化合物可能通过作用于IL-6、VEGFA、TNF、TP53、EGF等关键蛋白和神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路等主要通路，干预心血管相关的生物过程，从而发挥治疗作用，为更加深入研究BYD的药效物质奠定基础。