甲状腺癌组织中NF-κB、HMGB1表达

张凡 齐鹏飞 李道明 张会娟

(商丘医学高等专科学校 1外科学教研室，河南 商丘 476000；2医学技术系；郑州大学第一附属医院 3病理科；4内分泌科)

甲状腺癌(TC)作为临床多见的一种恶性肿瘤，其患病率受人类生活方式及人口老龄化等因素的影响正呈逐年升高趋势，对人类生命健康造成了极大威胁〔1,2〕。与临床上多种恶性肿瘤相似，TC发病早期的隐匿性极强，绝大多数患者确诊时已是中晚期，预后普遍不良〔3〕。因此，寻找一种有效诊断TC的手段具有极其重要的意义。核因子(NF)-κB p65属于NF-κB的重要成员之一，可能参与多种炎症因子表达过程，继而间接影响肿瘤的发生、发展过程〔4〕。高迁移率族蛋白(HMG)B1是核内结合蛋白之一，主要是介导了基因重组、复制及修复过程，可能通过Ras信号通路等途径刺激细胞的异常增殖〔5〕。本文拟分析TC组织中NF-κB、HMGB1表达，旨在为临床TC的诊断提供新的靶点与思路。

1 对象与方法

1.1一般资料 选取郑州大学第一附属医院2015年1月1日至2016年12月30日收治的91例TC患者，男32例，女59例；年龄51～78岁，平均(61.35±10.72)岁；肿瘤直径0.8～3.3 cm，平均(1.35±0.32)cm；有淋巴结转移45例。入组标准〔6〕：(1)所有入组人员完成影像学检查和手术病理活检且确诊为TC；(2)年龄>50岁；(3)入组前尚未接受抗肿瘤干预。剔除标准：(1)意识障碍或无法完成相关检查者；(2)伴有其他恶性肿瘤者；(3)研究期间因故退出者。本研究经医院伦理委员会获悉并核准。

1.2仪器及试剂 电热恒温培养箱(购自上海博工实验设备制造厂)；手提式压力蒸汽灭菌器(购自上海医用核子仪器厂)；显微镜(购自南京麒麟科学仪器集团有限公司)；干燥箱(购自中国科学院上海光机所)。兔抗人NF-κB p65、HMGB1多克隆抗体均购自博士德生物工程有限公司；自行配制磷酸盐缓冲液(PBS)，枸橼酸盐抗原修复液，二氨基联苯胺(DAB)底物工作液及过氧化氢。

1.3研究方法 (1)制作切片：分别将所有受试者术中切除获取的甲状腺组织取材2 mm左右，以浓度为4%的甲醛溶液进行固定，梯度乙醇脱水处理。随后进行石蜡包埋，冷冻处理后作厚度为4 μm的连续切片。并将切片放置于60℃烤箱中烘烤2 h，最后置于4℃冰箱中保存待检。(2)苏木素-伊红(HE)染色：对上述处理好的切片进行脱蜡处理，分别放置在无水乙醇Ⅰ中5 min，流水反复冲洗3 s；无水乙醇Ⅱ中5 min，流水反复冲洗3 s；95%乙醇中5 min，流水反复冲洗3 s；80%乙醇中5 min，流水反复冲洗3 s；蒸馏水中5 min，流水反复冲洗3 s；苏木素中5 min，流水反复冲洗3 s；1%盐酸乙醇中3 s，流水反复冲洗30 s；0.5%伊红液中4 min，蒸馏水冲洗2 s。梯度乙醇中脱水各2 min，最后置于二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中各5 min，并封片。(3)SP染色：取出切片脱蜡水化，依次置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ及不同梯度乙醇中浸泡，并以PBS重复清洗3次，5 min/次。以枸橼酸抗原修复液进行抗原修复，并将切片置于抗原修复液中，同时置入手提压力蒸汽灭菌器中，待观察到蒸汽冒出后2 min取出，以自来水冲洗30 min，PBS冲洗3次，5 min/次。滴加过氧化氢孵育，PBS冲洗，阻断内源性过氧化物酶活性。随后滴加山羊血清，进行时长为15 min的孵育，封闭非特异性抗原。滴加50 μl一抗，并以1∶100比例进行稀释，随后放置在4℃冰箱中过夜。翌日恢复至室温，采用PBS冲洗3次，5 min/次。滴加生物素二抗工作液1滴，孵育15 min，PBS冲洗3次，5 min/次。滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，孵育15 min，PBS液冲洗3次，5 min/次。DAB显色，树胶封片。

1.4评价标准〔7〕NF-κB p65、HMGB1均定位在细胞核或细胞质，以棕黄色颗粒为阳性细胞。随机选择10个视野，每个视野观察100个细胞，细胞核或细胞质基本不着色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。阳性细胞占比<5%计0分；5%～25%计1分；26%～50%计2分；>50%计3分。将两项评分的乘积作为最终结果，将0～1分为阴性，≥2分为阳性。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0软件进行方差齐性检验、t检验及χ2检验。

2 结 果

2.1差异性甲状腺组织中NF-κB p65、HMGB1表达比较 TC组织中NF-κB p65、HMGB1阳性率(87.91%，80例；68.13%，62例)均高于癌旁正常组织(20.88%，19例；8.79%，8例)，差异有统计学意义(χ2=82.417、67.693，均P=0.000)，见图1。

NF-κB p65表达

HMGB1表达

2.2TC组织中NF-κB p65、HMGB1表达和临床病理特征的关系 肿瘤直径≥1.0 cm、有淋巴结转移TC患者NF-κB p65、HMGB1阳性率高于肿瘤直径<1.0 cm、无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 TC组织中NF-κB p65、HGMB1表达和临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.3TC组织中NF-κB p65、HMGB1表达与预后的关系 TC死亡患者NF-κB p65、HMGB1阳性率〔57例(95.00%)、48例(80.00%)〕高于存活患者〔23例(74.19%)、14例(45.16%)〕，差异有统计学意义(χ2=8.327、11.426；P=0.004、0.001)。

3 讨 论

目前普遍认为，遗传、放射性接触和碘摄入量异常等因素均可能参与了TC的发生、发展过程〔8〕。早期诊治对患者预后的改善具有积极作用，其中CT、磁共振成像(MRI)及病理检查等均是临床上诊断TC的重要手段〔9～11〕。其中病理检查是全球范围内公认的TC诊断金标准，但该检查会对受检者造成一定的创伤，且对受检者耐受性与配合度要求均较高，具有较高的临床推广局限性〔12～14〕。其中CT与MRI等影像学检查虽可为医生提供病灶数目及直径等信息，却难以完成对病灶性质的鉴别，可能出现假阳性及假阴性情况。随着近年来相关研究的不断深入，分子诊断开始在TC的诊断中受到了广泛关注。

本文结果显示，TC组织中NF-κB p65、HMGB1表达异常升高，与杜朝阳等〔15〕研究相符。分析原因，NF-κB p65可通过C段结构域夹心结构形成二聚体，且经由信号传导通路对细胞凋亡、炎症介质的释放及肿瘤形成起到调节作用。HMGB1作为存在于真核细胞核内的一种非组蛋白染色体结合蛋白，但受到外界信号刺激时，其赖氨酸残基会被乙酰化，并释放至细胞外，于DNA的重组、复制及修复过程中发挥至关重要的作用，且可通过激活MAPK及Ras等多种信号通路，刺激炎症反应及细胞的异常增殖，对细胞恶变具有积极促进作用〔16～18〕。

此外，TC组织中NF-κB p65、HMGB1表达和肿瘤大小及淋巴结转移密切相关，即随着上述两项蛋白表达的升高，TC患者的肿瘤越大，淋巴结转移发生风险越高。考虑原因可能是NF-κB p65可直接或间接诱导抗肿瘤细胞的凋亡，继而促进肿瘤细胞增殖，同时可上调和肿瘤细胞浸润及生长密切相关的多种基因表达，在肿瘤发展、转移过程中起至关重要的作用。HMGB1可通过促进细胞外钙离子内流，从而提高内皮生长因子的活性，实现对细胞外信号调节激酶的活化作用，继而引起细胞骨架肌动蛋白结构的变化，提升细胞运动性，间接参与肿瘤细胞的转移过程。同时，HMGB1可通过和纤溶酶原系统相结合，继而发挥激活多种基质金属蛋白酶(MMPs)活性的作用，起到细胞外基质降解作用，从而促进了肿瘤转移及浸润〔19,20〕。

另外，随着NF-κB、HMGB1表达的不断升高，TC患者预后越差。

究其原因，可能是由于NF-κB、HMGB1表达的异常升高，在一定程度上反映了患者的病情不断恶化、浸润及转移风险较大，从而增加了临床治疗的难度，对预后造成不利影响。

综上，TC组织中NF-κB、HMGB1均存在异常高表达，且和肿瘤大小、淋巴结转移及预后转归密切相关。