LncRNA MIR4697HG通过靶向miR-193a-3p调控HMGA2表达促进胶质瘤的发生发展

丁锦荣 刘小江 李军 管义祥 (南通大学附属海安医院神经外科，江苏 南通 226600)

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，它起源于胶质细胞，是人类肿瘤死亡的主要原因之一〔1,2〕。根据报道，脑肿瘤的发病率为21/100 000，约占人类所有癌症的2%，其中，胶质瘤的发病率约占脑肿瘤的60%〔3〕。尽管胶质瘤的治疗发展迅速，其预后和生存率仍面临着挑战。因此，迫切需要探索胶质瘤进展的确切分子机制，开发新的有效治疗策略，以改善患者预后。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200核苷酸的非编码RNA，最初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产品，没有生物学功能〔4,5〕。研究表明，LncRNA广泛参与许多重要的调控过程，可能可以作为胶质瘤等多种人类癌症的治疗靶点〔6〕。LncRNA MIR4697 host gene(MIR4697HG)与肺腺癌临床特征相关〔7〕，MIR4697HG在卵巢癌中高表达，促进卵巢癌细胞的生长和转移〔8〕。而尚未对胶质瘤中的MIR4697HG进行研究。微小RNA(miRNA/miR)是一类小的非编码RNA，其异常表达对于各种癌症的发生发展有重要意义〔9〕。结直肠癌中miR-193a-3p下调表达，上调其表达抑制结直肠癌细胞增殖和发展〔10〕。但目前miR-193a-3p在胶质瘤中的生物学功能尚未明确。高迁移率族蛋白(HMG)A2被发现在胶质瘤中过表达，促胶质瘤的侵袭和不良预后〔11〕，FoxD2-AS1通过miR-185-5P靶向调控HMGA2表达，促进胶质瘤的发生与发展〔12〕。基于此，本研究对LncRNA MIR4697HG影响胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力进行评价，并结合miR-193a-3p和HMGA2初步探讨其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 正常星形胶质细胞HA、胶质瘤细胞U-251MG购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量-聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司；β-肌动蛋白(β-actin)、HMGA2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；miR-con、miR-193a-3p、si-con、si-MIR4697HG、anti-miR-con、anti-miR-193a-3p、荧光素酶报告载体购自上海Gene Pharma公司；噻唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司。

1.2细胞培养 HA、U-251MG细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿润的培养箱中培养。待细胞密度达约70%，使用胰酶消化、传代。

1.3qPCR检测LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA表达 选取生长状态良好的HA、U-251MG细胞，接入TRIzol试剂提取总RNA，并逆转录成cDNA，以合成的cDNA为模板，按照qPCR试剂盒的说明进行反应。LncRNA MIR4697HG正向引物序列为5′- TTCCCCAGGAGGGACTTTGA-3′，反向引物序列为5′-GTGTGTCCTCAGACCACCAG-3′。miR-193a-3p引物序列参照王培蓓等〔13〕的报道，HMGA2正向引物序列为5′-AAAGCAGCTCAAAAGAAAGCA-3′，反向引物序列为5′-TGTTGTGGCCATTTCCTAGGT-3′。LncRNA MIR4-697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA表达量依照2-ΔΔCt法计算。

1.4Western印迹检测HMGA2蛋白表达 使用放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液提取HA、U-251MG细胞蛋白，吸取适量蛋白进行10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，分离蛋白样品，并转至聚偏氟乙烯膜(PVDF)，之后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入HMGA2一抗4℃孵育过夜，同时以β-actin作为对照，经Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)漂洗10 min，重复3次后，加入二抗孵育2 h，TBST漂洗，曝光显影，分析HMGA2蛋白条带灰度值。

1.5细胞转染 转染前24 h，在6孔板中接种U-251MG细胞，当细胞达约70%密度时，按照Lipofectamine 2000试剂说明书指示，将miR-193a-3p、si-MIR4697HG、anti-miR-193a-3p及其阴性对照转染入U-251MG细胞。转染48 h后，收集U-251MG细胞，参照1.3、1.4所述方法检测LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA和HMGA2蛋白、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达，并进行其他指标检测。

1.6生物信息学预测和双荧光素酶活性检测 StarBase网站(http://starbase.sysu.edu.cn/)对MIR4697HG与miR-193a-3p、miR-193a-3p与HMGA2的靶向结合进行预测，发现MIR4697HG与miR-193a-3p、miR-193a-3p与HMGA2有部分核苷酸序列可分别形成互补配对。构建含有miR-193a-3p结合位点的LncRNA MIR4697HG-3′野生型(MIR4697HG-3′WT)及突变型(MIR4697HG-3′MUT)报告基因载体，在U-251MG细胞中转染miR-193a-3p和LncRNA MIR4697HG WT及MUT报告基因载体。构建含有miR-193a-3p结合位点的HMGA2-3′非编码区(3′UTR)HMGA2-3′UTR-WT及HMGA2-3′UTR-MUT报告基因载体，在U-251MG细胞中转染miR-193a-3p mimics和HMGA2-3′UTR WT及MUT报告基因载体。之后，进行双荧光素酶活性检测。

1.7MTT检测细胞增殖 收集U-251MG细胞，在96孔板中接种1×104个/ml，培养48 h，添加100 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，加入200 μl二甲基亚砜，37℃振荡培养10 min，反应结束后置酶标仪检测U-251MG细胞的吸光(OD)值，检测波长设为490 nm。细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%

1.8Transwell检测细胞迁移和侵袭 检测U-251MG细胞迁移和侵袭时，用无血清培养基稀释细胞密度为1×105个/ml，加入Transwell上室(检测细胞迁移不加基质胶。检测细胞侵袭时，事先在Transwell上室涂布与无血清培养基充分混合的基质胶，静置3～4 h)，并在下室加入500 μl包含10%胎牛血清的培养基。孵育24 h后，无菌棉签擦除多余细胞，甲醛和结晶紫分别进行固定与染色，显微镜下观察、统计。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1胶质瘤细胞中LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p和HMGA2表达 与正常星形胶质细胞HA比较，胶质瘤细胞U-251MG中LncRNA MIR4697-HG、HMGA2 mRNA和HMGA2蛋白表达量明显升高，而miR-193a-3p表达量显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western印迹检测HMGA2蛋白的表达

表1 胶质瘤细胞中LncRNA MIR4697HG、HMGA2和 miR-193a-3p表达量

2.2LncRNA MIR4697HG靶向miR-193a-3p，miR-193a-3p靶向HMGA2 StarBase在线预测软件显示，miR4697HG与miR-193a-3p、miR-193a-3p与HMGA2具有靶向结合位点(图2)。双荧光素酶活性检测结果显示，相比于miR-con与MIR4697HG-3′WT报告质粒共转染，miR-193a-3p与MIR4697HG-3′WT共转染显著抑制荧光素酶相对活性(P<0.05)，而miR-con或miR-193a-3p与MIR4697HG-3′MUT共转染对荧光素酶相对活性无明显影响(P>0.05)，见表2。同时，相较于miR-con与HMGA2-3′UTR-WT共转染，miR-193a-3p与HMGA2-3′UTR-WT共转染明显降低荧光素酶相对活性(P<0.05)，miR-con或miR-193a-3p与HMGA2-3′UTR-MUT共转染对荧光素酶相对活性无明显影响(P>0.05)，见表3。

2.3低表达LncRNA MIR4697HG抑制胶质瘤U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭，影响miR-193a-3p和HMGA2的表达 在U-251MG细胞中转染si-MIR4697HG，发现MIR4697HG mRNA表达量明显低于si-con组，说明转染有效。与si-con组比较，低表达LncRNA MIR4697HG miR-193a-3p表达量明显增加(P<0.05)。而HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达量明显减少(P<0.05)。低表达LncRNA MIR4697HG的U-251MG细胞存活率明显低于si-con组(P<0.05)。相较于si-con组，低表达LncRNA MIR4697HG细胞迁移数量和细胞侵袭数量明显减少(P<0.05)，见图3，表4。

A StarBase对miR-193a-3p和LncRNA MIR4697HG结合进行预测示意；B StarBase对HMGA2和miR-193a-3p结合进行预测示意图2 miR-193a-3p靶向LncRNA MIR4697HG， HMGA2靶向miR-193a-3p

表2 双荧光素酶活性实验

表3 miR-con或miR-193a-3p与HMGA2-3′UTR WT及MUT报告质粒共转染U-251MG细胞后 双荧光素酶活性检测

A：Transwell检测胶质瘤的迁移和侵袭(结晶紫染色，×10)；B：Western印迹检测HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达 1～3：NC组，si-con组，si-MIR4697HG组

表4 低表达LncRNA MIR4697HG抑制胶质瘤U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭， 影响miR-193a-3p和HMGA2的表达

2.4高表达miR-193a-3p抑制胶质瘤细胞U-251MG增殖、迁移和侵袭，影响HMGA2的表达 在U-251MG细胞中转染miR-193a-3p后miR-193a-3p表达量明显高于miR-con组(P<0.05)，表明转染成功。与miR-con组比较，高表达miR-193a-3p HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9、细胞存活率、细胞迁移数量和细胞侵袭数量明显减少(P<0.05)，见图4、表5。

A：Transwell检测胶质瘤的迁移和侵袭(结晶紫染色，×10)；B：Western印迹检测HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达 1～3:NC组，miR-con组，miR-193a-3p组

表5 高表达miR-193a-3p抑制胶质瘤细胞U-251MG增殖、迁移和侵袭，影响HMGA2的表达

2.5敲减miR-193a-3p可部分逆转MIR4697HG低表达对U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-MIR4697HG+anti-miR-con组比较，si-MIR4697HG与anti-miR-193a-3p共转染显著提高CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、细胞存活率、细胞迁移数量和细胞侵袭数量(P<0.05)，见表6、图5。

2.6高表达HMGA2可部分逆转MIR4697HG低表达对U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-MIR4697HG+pcDNA-con组比较，si-MIR4697HG与pcDNA-HMGA2共转染显著提高HMGA2、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、细胞存活率、细胞迁移数量和细胞侵袭数量(P<0.05)，见图6、表7。

表6 敲减miR-193a-3p可部分逆转MIR4697HG低表达对U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响

A：Transwell检测胶质瘤的迁移和侵袭(结晶紫染色，×10)；B：Western印迹检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达； 1～2：si-MIR 4697HG+pcDNA-con组，si-MIR 4697HG+anti-miR-193a-3p组

A：Transwell检测胶质瘤的迁移和侵袭(结晶紫染色，×10)；B：Western印迹检测HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达； 1～2：si-MIR 4697HG+pcDNA-con组，si-MIR 4697HG+pcDNA-HMGA2组

表7 高表达HMGA2可部分逆转MIR4697HG低表达对U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨 论

胶质瘤是成人中枢神经系统肿瘤中发病率和死亡率最高的肿瘤。虽然治疗胶质瘤的方法有所进步，但由于治疗方案有限，患者的总体生存中值在诊断后往往低于12～18个月〔14〕。研究证实LncRNA在胶质瘤形成中的功能作用〔15〕。例如，抑制lncRNA ZEB1-AS1可抑制U87MG胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡〔16〕。lncRNA GAS5的过表达抑制了胶质瘤U251和U87细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡〔17〕。本研究结果与Zhang等〔8〕报道一致。作为一种高度保守的内源性非编码RNA，miRNA通过与靶基因的3′UTR结合，调控靶基因表达，在包括发育、细胞增殖和分化在内的多种生物学事件中发挥重要作用。miR-193a-3p在大多数癌症中充当抑癌基因，如胰腺导管腺癌〔18〕、胃癌〔19〕、前列腺癌〔20〕等。miR-193a-3p在结直肠癌组织中下调，并与患者的预后密切相关〔21〕。本研究qPCR结果与miR-193a-3p过表达抑制肺癌细胞增殖和迁移的研究相符〔22〕，提示在胶质瘤中，miR-193a-3p可能扮演着抑癌基因的角色，抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。HMGA2被证明在胶质瘤中促进增殖、侵袭、迁移和不良预后〔23〕。本研究结果表明LncRNA MIR4697HG可能通过靶向miR-193a-3p并调控HMGA2表达，从而影响胶质瘤的发生发展。

综上，LncRNA MIR4697HG在胶质瘤细胞中表达显著上调，抑制其表达则明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制与靶向miR-193a-3p调控HMGA2表达有关。另外，miR-193a-3p在胶质瘤细胞中明显下调，上调其表达导致胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制。本研究对胶质瘤发病机制进行初步探索，为胶质瘤提供了潜在的生物标志物和治疗靶点。