重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达

廖亮，王琴容，杨国辉

1 贵州医科大学附属医院，贵阳550004；2 贵州省医学分子生物学重点实验室

在高等真核细胞生物中，基因表达的调控是一个复杂而严格的调控过程，涉及许多不同的因素和控制水平。生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程,基因表达调控主要发生在转录水平。基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机制上,对基因调控的研究将是今后相当长一段时间内功能基因组学研究的热点之一[1]。目前，双荧光素酶报告基因检测已成为研究转录因子参与基因调控的有效手段,通过对启动子DNA片段的分析，验证启动子结合元件的反式激活能力,探讨转录因子在信号转导中的分子机制[2]，在分子生物学中常用来研究基因功能、基因与基因间的调节、蛋白与基因的作用以及非编码RNA对基因表达的调控[3]。双荧光素酶报告基因检测中，海肾荧光素酶为报告基因，萤火虫荧光素酶为内参基因，两个荧光素酶基因都有自己的启动子、终止位点，二者独立表达且互不干扰[4]。常见双荧光素酶报告基因载体有pGL3-Basic、pRL-TK等，但是pGL3-Basic载体只表达萤火虫荧光素酶，而pRL-TK载体则只表达海肾荧光素酶，每次实验时需将两个载体共同转染进细胞中。本研究应用了由Promega公司研发的一种双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2，它同时含有以上两种报告基因，即双荧光素酶报告基因整合在同一个载体上，使检测偏差更小且质粒转染比双质粒转染更简单易行。在psiCHECK-2载体质粒中，海肾荧光素酶被用作主要的报告基因，将目的基因克隆到位于海肾荧光素酶下游的多克隆位点，通过比较过表达或者干扰miRNA后检测报告基因的表达，可以定量反应miRNA对目的基因的调控作用[5]，还可结合定点突变等方法进一步确定miRNA和靶基因3′UTR的作用位点[6]；此外，该载体质粒还可以用来验证miRNA同长链非编码RNA的靶向作用，鉴定特定转录因子同其调控序列的作用以及分析信号通路激活等[7]。2019年3月10日～2019年6月9日，我们成功构建了双荧光素酶报告重组基因质粒psiCHECK-2-Intron，观察其转染非小细胞肺癌细胞株PC-9后细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达情况，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 质粒、试剂及细胞 双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2购自美国Promega公司，RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清购自Gibco公司；DNA转染试剂盒购自北京码因科技公司；提取总RNA的TRIzol试剂以及普通PCR试剂购自Invitrogen公司；gDNA Eraser、Reverse Transcription、T4 DNA Ligase试剂盒以及SYBR Green试剂盒购自Takara公司；PCR仪购于美国赛默飞公司StepOnePlus ；双荧光酶检测试剂采用购自于GeneCopoeia公司的Luc-Pair Duo-Luciferase；非小细胞肺癌细胞株PC-9及感受态大肠杆菌E.coli DH5α由本实验室保存；实时RT-PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.2 重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron的构建与鉴定 以psiCHECK-2中的嵌合体内含子(设计长度为133 bp)为模板，分别设计含有相关酶切位点的特异性引引物。嵌合体内含子正向引物5′- GTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCG-

ACCCTGCAGCGACCCGCTTAAAAGCTTGGCATTCCG-GTAAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGG-3′，反向引物为5′- GCAGGGCCCTTCTTAATGTTCTTAGCATC-GGCCATGGTGGCTTTACCAACCTGTGGAGAGAAAG-GCAAAG -3′；海肾荧光素酶基因正向引物为5′- TGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTG -3′，反向引物为5′- TGCTCGGGGTCGTACACCTTGGAA -3′；萤火虫荧光素酶基因正向引物为5′- AAAGCTTGGCATTCCGGTAAGGTT -3′，反向引物为5′- GTGGGCATCGGTGAAGGCAA -3′。PCR反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，58 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40个循环。将PCR产物和psiCHECK-2载体质粒用快速连接试剂盒在16 ℃温度下连接12 h，即获得重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron。取重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron，转染至感受态大肠杆菌E.coli DH5α中，然后接种于Luria-Bertani培养基(LB)平板上，培养48 h后筛选出单克隆菌落，以嵌合体内含子为目的基因片段，常规进行琼脂糖凝胶电泳实验，观察目的基因片段长度，并对目的基因片段进行基因测序。

1.3 重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron转染及转染细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶检测

1.3.1 重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron转染及转染细胞中萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因检测 将PC-9细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，期间每隔24 h更换培养基一次，待细胞完全贴壁以后，用0.25%胰蛋白酶将其消化并传代，按照Entranster-H4000转染试剂说明书要求分别将重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron、双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2转染至PC-9细胞中，记为转染组、对照组，采用qRT-PCR法检测两组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA。用TRIzol试剂提取PC-9细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系包括cDNA 0.5 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、无菌水8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃、2 min，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt表示细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3.2 重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron转染及转染细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶活性检测 采用双荧光素酶活性实验。取两组细胞放入96孔板，加入80 μL细胞裂解液裂解10 min，然后加入萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物，使用BioTek Synergy 2多功能酶标仪检测两组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron的鉴定结果 琼脂糖凝胶电泳实验结果显示，观察到目的基因片段长度为133 bp，与预期设计的目的片段长度相符，证明嵌合体内含子成功插入psiCHECK-2载体中。重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron的基因测序结果显示，嵌合体内含子目的基因序列正确，无突变和缺失，表明重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron结构图见图1。

注：图中箭头方向代表转录的方向，∧代表插入的嵌合体内含子目的基因片段。

图1重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron结构图

2.2 重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron转染细胞PC-9中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达 转染组细胞中萤火虫荧光素酶mRNA、海肾荧光素酶mRNA的相对表达量分别为2.213±0.038、2.004±0.025，对照组分别为1.004±0.012、1.003±0.010，两组相比，P均<0.05。转染组细胞中萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性分别为2.974±0.099、1.948±0.052，对照组分别为1.000±0.018、1.000±0.020，两组相比，P均<0.05。

3 讨论

在高等真核细胞生物中，基因表达的调控是一个复杂而严格的调控过程，涉及许多不同的因素和控制水平。生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程,基因表达调控主要发生在转录水平。基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机制上,对基因调控的研究将是今后相当长一段时间内功能基因组学研究的热点之一。本研究选用的psiCHECK-2载体巧妙的将两个荧光素酶报告基因融合在同一质粒上，这样可以在一次实验中同时检测两种荧光素酶活性，而不必分开进行检测，因此可以在很大程度上避免在逆转录过程中质粒DNA污染样本的对实验结果的干扰，并省略了在逆转录前必须加入DNase去除DNA的繁琐过程，从而进一步提高了实验操作的效率，节省了时间，而且也能在很大限度上减少样本污染的机率，同时也在最大程度上减少了不同批次内和批次间的实验结果之间的差异，为科研工作带来了很大便利。本研究中，我们以psiCHECK-2载体质粒为基本框架，通过在萤火虫荧光素酶报告基因上游插入嵌合体内含子，构建重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron，分别应用琼脂糖凝胶电泳实验和基因测序结果显示重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建成功。

同时，我们发现插入的嵌合体内含子在一定程度上增强了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的表达。本研究结果显示，重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后，萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均发生了变化。在真核生物的细胞中，内含子已被证实能显著促进氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因在小鼠体内的表达[8]。另一项研究[9]证实，内含子能促进绿色荧光蛋白(GFP)在293T细胞中的表达。还有研究[10]表明，嵌合体内含子能够大幅度提高重组神经生长因子(NGF)在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达，并且证实了内含子调控转基因表达具有方向性。另外，还有一些内含子对于基因的表达有直接或间接的负面影响[11,12]。其中的机制目前还不清楚，有待进一步的研究探讨。本研究选择PC-9细胞系作为受试细胞，是因为PC-9细胞具有容易培养，细胞贴壁能力强和高转染效率等特点[13]，所以选择该细胞来进行荧光素酶报告基因分析，实验结果可信度更高。

总之，本研究成功构建了重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron；重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron转染PC-9细胞后，细胞中萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的表达均升高。该质粒的成功构建为下一步研究沉默基因对非小细胞肺癌细胞PC-9上皮间质转化的影响提供了一种新的实验手段和工具。