慢病毒载体介导的circ_0091581通过靶向miR-1256调控肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭迁移的机制*

温松奇, 肖 定, 游 建

武汉市第四医院，华中科技大学同济医学院附属普爱医院肝胆胰疝外科，武汉 430033

肝癌是导致死亡的第二大癌症，其中肝细胞癌是原发性肝癌的最主要类型，靶向治疗为不适合手术的肝癌患者带来新的希望[1-2]。研究表明circRNA通过调节各种生物学过程在肝癌进程中发挥作用，可作为诊断、预后生物标志物以及肝癌治疗靶标[3]。研究报道circ_0091581高表达可增强肝癌细胞的活力，抑制其凋亡[4]。circ_0091581表达与肝癌患者的肿瘤大小、无病生存率和总体生存率相关；circ_0091581通过阻止miR-526b降解c-MYC mRNA来促进肝癌细胞的增殖[5]。研究报道miR-1256过表达通过调节结构蛋白家族1(TCTN1)抑制非小细胞肺癌的增殖和迁移[6]。miR-1256通过靶向5-羟色胺3A(HTR3A)抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖和细胞周期进程[7]。circ-DCAF6通过降低miR-1231和miR-1256的水平促进胃癌细胞生长和侵袭[8]。然而miR-1256对肝癌细胞增殖、凋亡和侵袭迁移的影响，及circ_0091581是否通过调控miR-1256影响肝癌进展尚不清楚。因此，本实验旨在研究circ_0091581是否通过调控miR-1256影响肝癌进展。

1 材料与方法

1.1 组织材料

选取武汉市第四医院20例肝癌患者的癌组织及癌旁组织，所有患者均具有完整临床病理资料，术前未进行过放化疗，所有患者均知情且同意。

1.2 细胞与主要试剂

肝癌细胞株Huh7购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自武汉纯度生物科技有限公司；荧光定量试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒购自上海歌凡生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel购自美国BD公司；凋亡检测试剂盒、蛋白提取试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 细胞处理与分组

肝癌细胞株Huh7用RPMI-1640培养液培养，将干扰circ_0091581的慢病毒载体和阴性对照转染至Huh7细胞中，分记为si-circ_0091581组、si-NC组；将miR-NC、miR-1256转染至Huh7细胞中，记为miR-NC组、miR-1256组；将干扰circ_0091581的慢病毒载体分别与anti-miR-NC、anti-miR-1256转染至Huh7细胞中，记为si-circ_0091581+anti-miR-NC组、si-circ_0091581+anti-miR-1256组。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0091581和miR-1256的表达水平

提取组织及细胞总RNA，反转录成cDNA，按试剂盒说明进行PCR，循环条件为95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环；相对表达量用2-ΔΔCt法计算。circ_0091581和miR-1256分别以GAPDH和U6为内参，circ_0091581上游引物序列：5′-GGGCTAGACTTACAGATTGGCA-3′，下游引物序列：5′-GTTCCCTTCTTCGGCTGGAT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GATTGCCGTTCATCCATCTT-3′，下游引物序列：5′-AACAGCAAAGGGGTCACATC-3′；miR-1256上游引物序列：5′-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3′，下游引物序列：5′-TTTAATTACCAACCGAATACG-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCA-CGAATTTGCGTGTCA-3′。

1.5 MTT检测细胞增殖活性

细胞培养48 h，每孔加入MTT溶液20 μL，孵育4 h后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡反应10 min使沉淀溶解，用酶标仪于波长450 nm处检测吸光度(A)值。

1.6 Transwell检测细胞迁移和侵袭

各组细胞无血清培养，取200 μL接种于Transwell小室上层，培养24 h，吸去培养液，用棉签轻轻擦去上层细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下随机选取5个视野进行拍照并计数。细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入50 μL基质胶Matrigel，凝固后接种细胞，其余同迁移实验操作。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

细胞培养48 h，用预冷的PBS漂洗2次，与500 μL的结合缓冲液混匀；先加入10 μL的膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)，再加入5 μL的碘化丙啶(PI)，混匀后避光孵育10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，取50 μL蛋白样品于10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中进行电泳，转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5 %的牛血清蛋白封闭1 h；加入一抗4℃过夜，加入二抗室温培养1 h，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析各蛋白条带的灰度，蛋白表达水平以目的条带和GAPDH条带的比值表示。

1.9 双荧光素酶报告实验

构建circ_0091581的野生型和突变型荧光素酶载体WT-circ_0091581和MUT-circ_0091581，将其分别与miR-NC和miR-1256共转染至Huh7细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性。

将pcDNA、pcDNA-circ_0091581、si-NC、si-circ_0091581转染至Huh7细胞中，按1.4中方法检测miR-1256表达水平。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 circ_0091581和miR-1256在肝癌组织中的表达

与癌旁组织比较，肝癌组织中circ_0091581表达水平升高(3.22±0.07vs.0.99±0.01)，miR-1256表达水平降低(0.37±0.01vs.1.00±0.01)，均P<0.05。

2.2 抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞增殖的影响

与si-NC组比较，si-circ_0091581组circ_0091581表达水平降低，细胞增殖活性降低，Ki-67表达水平降低，P21表达水平升高(均P<0.05)(图1，表1)。

图1 增殖相关蛋白表达

表1 抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞增殖的影响

2.3 抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞迁移侵袭的影响

与si-NC组比较，si-circ_0091581组迁移、侵袭细胞数减少，MMP-2、MMP-9表达水平降低(均P<0.05)(图2，表2)。

A：迁移侵袭相关蛋白表达；B：肝癌Huh7细胞的迁移侵袭

表2 抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞迁移侵袭的影响

2.4 抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞凋亡的影响

与si-NC组比较，si-circ_0091581组细胞凋亡率升高[(23.89±1.05)%vs.(7.24±0.30)%]，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(均P<0.05)(图3)。

A：凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图

2.5 circ_0091581靶向调控miR-1256的表达

Circinteractome预测显示circ_0091581的序列中含有与miR-1256互补的核苷酸序列(图4)；WT-circ_0091581与miR-1256共转染的细胞荧光素酶活性降低(0.37±0.02vs.0.98±0.03，P<0.05)，MUT-circ_0091581与miR-1256共转染的细胞荧光素酶活性无显著差别(1.00±0.02vs.1.02±0.01，P>0.05)。与pcDNA组比较，pcDNA-circ_0091581组circ_0091581表达水平升高(3.30±0.19vs.0.99±0.02)，miR-1256表达水平降低(0.46±0.01vs.1.02±0.01)(均P<0.05)；与si-NC组比较，si-circ_0091581组circ_0091581表达水平降低(0.39±0.02vs.1.01±0.02)，miR-1256表达水平升高(2.86±0.15vs.1.01±0.02)(均P<0.05)。

图4 circ_0091581的序列中含有与miR-1256互补的核苷酸序列

2.6 miR-1256过表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

与miR-NC组比较，miR-1256组miR-1256表达水平升高，细胞活性降低，迁移侵袭细胞数减少，细胞凋亡率升高(均P<0.05)；Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达水平降低(均P<0.05)；P21、Bax表达水平升高(均P<0.05)(图5，表3，表4)。

A：肝癌Huh7细胞的迁移侵袭；B：细胞凋亡流式图

表3 miR-1256过表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

表4 miR-1256过表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响

2.7 下调miR-1256表达逆转了抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用

与si-circ_0091581+anti-miR-NC组比较，si-circ_0091581+anti-miR-1256组miR-1256表达水平降低，细胞活性升高，迁移侵袭细胞数增加，细胞凋亡率降低；Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达水平升高(均P<0.05)；P21、Bax表达水平降低(均P<0.05)(图6，表5，表6)。

1：si-NC组；2：si-circ_0091581组；3：si-circ_0091581+anti-miR-NC组；4：si-circ_0091581+anti-miR-1256组；A：肝癌Huh7细胞的迁移侵袭；B：细胞凋亡流式图

表5 下调miR-1256表达逆转了抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用

表6 下调miR-1256表达逆转了抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达的作用

3 讨论

肝癌是全球最常见的癌症之一，已有分子靶向药物用于肝癌治疗，但因一些靶向药物的局限性，需要开发更有效的新型分子靶向药物[9-10]。研究表明circRNA参与调控肝癌的进展，如circRNA cSMARCA5抑制肝细胞癌的生长和转移[11]。circ_0000105过表达促进肝癌细胞增殖并抑制细胞凋亡[12]。已有研究报道circ_0091581影响肝癌进展，circ_0091581在肝细胞癌组织样品和细胞株中高表达；circ_0091581高表达可促进肝癌细胞增殖，抑制其凋亡[4]。本实验首先检测了肝癌组织中circ_0091581的表达，结果显示，肝癌组织中circ_0091581表达水平高于癌旁组织，提示circ_0091581可能在肝癌中起促癌作用，与前人研究结果一致。本实验进一步抑制circ_0091581表达后，Huh7细胞活性降低，迁移侵袭细胞数减少，细胞凋亡率升高；表明抑制circ_0091581表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭，并促进细胞凋亡，与前人研究结果一致。

为进一步研究circ_0091581影响肝癌进展的更多分子机制，本实验通过生物学软件预测circ_0091581下游可能靶向结合的miRNA，结果发现circ_0091581与miR-1256有结合位点。

研究报道结直肠癌组织中的miR-1256低表达，与TNM分期、淋巴结转移和患者生存期有关；是结直肠癌患者预后不良的独立预测参数[13]。miR-1256上调可抑制前列腺癌细胞的生长和侵袭[14]。以上研究表明miR-1256可影响多种肿瘤的进展，但其对肝癌的影响尚未明确。本实验首先检测了肝癌组织中miR-1256的表达水平，结果显示肝癌组织中miR-1256表达水平低于癌旁组织，提示miR-1256可能在肝癌中起抑癌作用。本实验进一步过表达miR-1256后，Huh7细胞活性降低，迁移侵袭细胞数减少，细胞凋亡率升高；表明过表达miR-1256可抑制肝癌细胞增殖、迁移侵袭，并促进细胞凋亡，揭示了miR-1256在肝癌中的作用，可作为肝癌治疗的分子靶标。

研究报道circ_0026134通过海绵化miR-1256和miR-1287调节非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭[15]。circHECTD1通过靶向miR-1256和激活β-catenin/c-Myc信号传导来促进谷氨酰胺分解以促进胃癌的增殖，迁移和侵袭[16]。以上研究表明circRNA可通过调控miR-1256影响肿瘤进展。本实验发现circ_0091581与miR-1256有结合位点，且进一步的双荧光素酶报告实验证实circ_0091581可靶向调控miR-1256；此外，下调miR-1256表达逆转了抑制circ_0091581表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的作用。

综上所述，抑制circ_0091581表达可能通过上调miR-1256抑制肝癌细胞增殖、侵袭迁移，促进凋亡。