内质网蛋白29在人上皮性卵巢癌顺铂化疗耐药中的作用*

周 婷, 刘荣华. 袁 明

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，武汉 430030

卵巢癌是女性生殖系统三大肿瘤之一，其病死率在其中位居榜首。因早期发现困难，预后差，卵巢癌被称为“沉默的杀手”。临床上化疗耐药时常发生，因此，深入探讨卵巢癌铂类化疗耐药机制，有利于了解疾病的发生发展，进而采取针对性的治疗措施来逆转化疗耐药，提高卵巢癌患者的预后及生存质量。

我们在前期通过二维电泳及蛋白质谱分析等实验表明：作为重要的内质网蛋白之一的ERp29在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达水平明显低于顺铂敏感株，在人卵巢癌组织标本中亦可见ERp29表达与正常组织比较差异具有统计学意义，夏庆安等[1]的研究也有相似结论。目前文献对ERp29报道较少，主要集中在胃肠道及乳腺肿瘤等方面，其与上皮性卵巢癌化疗耐药的关系尚未见报道。本研究拟通过分子生物学技术手段探讨ERp29对人上皮性卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的影响，希望能够进一步阐明其内在的机制，为实现卵巢癌精准化疗提供新的思路，进而改善卵巢癌患者预后。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株采用华中科技大学同济医学院附属同济医院妇科肿瘤实验室保存的大肠埃希菌DH5α；限制性内切酶购自Takara公司；抗人ERp29鼠单克隆抗体购自Abcam公司；抗人β-actin鼠单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自Santa Cruz公司；顺铂购自美国Sigma公司；G418、脂质体购自Gibco公司；沉默ERp29的siRNA通过Invitrogen网站设计，并由该公司合成，ERp29的有效沉默片段为(5′-3′)CCCTGGATACGGTCACTTT。

1.2 免疫组织化学检测

搜集临床卵巢癌组织样本，利用免疫组织化学检测ERp29的表达。石蜡包埋组织取自同济医院近5年来诊断为上皮性卵巢癌的患者，所有患者均接受了一期手术，随后完成了以顺铂为基础的化疗。将患者分为两组：化疗耐药组和化疗敏感组，定义如下。化疗耐药：术后化疗过程中，病情继续进展；CA125经6个疗程后未降至正常范围，或患者在首次化疗后6个月内复发。化疗敏感：患者6个月以上复发或无复发。化疗敏感组及化疗耐药组患者各有32例及15例。参与者被告知本研究的目的，并签署知情同意书。伦理审查获得了华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理审查委员会的批准。由2名观察者对切片进行盲式阅片，显微镜下随机选择5个高倍镜视野(×400)。将每张石蜡切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的分值：以胞质棕黄色颗粒状沉积为阳性，先按阳性细胞比例将无、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计为0～4分，再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0～3分，最后综合两部分得分即得到总评分，计算公式为H-score=Σpi(i+1)，其中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数，i代表着色强度。

1.3 细胞培养及实验分组

细胞株A2780来源于未经治疗的卵巢癌患者的癌变组织，购自European Collection of Cell Cultures(ECACC)。37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中于10% RPMI 1640完全培养液培养，细胞呈贴壁生长。本实验设立3个组，分别命名为NC组(未转染)、Control-siRNA组(转染对照siRNA)及ERp29-siRNA组(转染ERp29 siRNA)。

1.4 RT-PCR检测相关基因mRNA水平表达

收集细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，M-MLA反转录获得cDNA；PCR扩增以GAPDH为内参照，cDNA为模板。ERp29上游及下游引物：5′-CCTGGATACGGTCACTTTCTACA-3′和5′-AGTTTTCAGCAAGACGCTTGA-3′。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。GAPDH上游及下游引物：5′-ACGGATTTGGTC-GTATTGGG-3′及5′-TGATTTTGGAGGGATC-TCGC-3′。反应件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s，29个循环；72 ℃终延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，紫外灯观察，拍照，至少重复3次。

1.5 Western blot检测相关基因蛋白表达水平

收集细胞后采用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，行SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜，5%脱脂奶室温封闭2 h，一抗4 ℃过夜，含0.05% Tween20的TBS缓冲液漂洗3次，每次漂洗10 min，加入碱性磷酸酶标记的二抗(1∶1 000)，室温反应1 h，用NBT/BCIP/AP缓冲液(1∶1∶250)显色，以β-actin作为参照，至少重复3次。

1.6 CCK-8检测各组细胞对顺铂的敏感性

用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×104个细胞/mL，取细胞悬液按100μL/孔接种于96孔板中培养。将培养板在37 ℃、5% CO2条件下的恒温培养箱中预培养24 h及48 h后，向每孔加10 μL CCK-8溶液，移入培养箱中继续孵育，在不同的时间点取出培养板，全自动酶标仪测定每孔的吸光度(A)值，并绘制细胞增殖曲线。顺铂作用浓度梯度为1、2、4、8、16、32μmol/L，后续实验参照此浓度梯度。

1.7 FACS检测各组细胞的凋亡率及细胞周期变化

收集经上述浓度梯度顺铂作用24 h及48 h的各组细胞，冷PBS洗涤，-20 ℃，75%乙醇固定过夜，细胞洗涤后，常规离心(1500 r/min)15 min(No.11030，r=15 cm，Sigma)，加入0.1% RNase A和10 μg/mL碘化丙啶(PI)的PBS液500 μL，室温避光，染色30 min后上流式细胞仪测定细胞凋亡率及细胞周期。

1.8 统计学方法

以上所有的实验均重复3次，数据结果用均数±标准差表示，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。多组间均数比较采用单因素方差分析，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERp29在人上皮性卵巢癌组织中的表达

运用免疫组织化学方法检测卵巢癌组织中ERp29的表达情况，结果表明：在化疗耐药的卵巢癌患者组织标本中，ERp29的表达明显低于化疗敏感者，化疗耐药组的平均免疫组织化学评分为38.12分，而化疗敏感组的平均免疫组织化学评分为92.43分，两组间差异具有统计学意义(P< 0.05)，见图1。

A：化疗耐药卵巢癌组织(×100)；B：化疗耐药卵巢癌组织(×400)；C：化疗敏感卵巢癌组织(×100)；D：化疗敏感卵巢癌组织(×400)

2.2 各组细胞中ERp29的mRNA表达水平

凝胶电泳评价各组细胞ERp29 mRNA表达的差异。由图2可见，Control-siRNA组和NC组细胞条带明亮清晰，而ERp29-siRNA组细胞条带模糊，三者相对表达强度(ERp29/GAPDH)分别为0.52±0.04、0.55±0.06及0.13±0.03，后者与前两组相比差异有统计学意义(均P< 0.05)。

①NC组；②Control-siRNA组；③ERp29-siRNA组；与ERp29-siRNA组比较 *P< 0.05

2.3 各组细胞中ERp29的蛋白表达水平

转染siRNA后，通过Western blot验证对ERp29基因的沉默效应，由图3可见，ERp29-siRNA、Control-siRNA和NC组细胞中ERp29蛋白相对表达强度(ERp29/β-actin)分别为0.15±0.04，0.55±0.06和0.58±0.07，ERp29-siRNA组ERp29蛋白表达水平与其他两组相比差异有统计学意义(均P< 0.05)。

①NC组；②Control-siRNA组；③ERp29-siRNA组；与ERp29-siRNA组比较 *P< 0.05

2.4 各组细胞的生长抑制率

不同浓度顺铂作用24 h及48 h后，ERp29-siRNA组细胞生长抑制率明显低于Control-siRNA组，两组间的差异具有统计学意义(均P< 0.05)，而NC和Control-siRNA组间差异无统计学意义(图4)。

A：顺铂作用24 h细胞生长抑制率；B：顺铂作用48 h细胞生长抑制率；与ERp29-siRNA组比较，*P< 0.05

2.5 各组细胞的凋亡率

不同浓度顺铂作用24 h及48 h后，ERp29-siRNA组细胞的凋亡率明显低于两个对照组，差异均具有统计学意义(均P< 0.05)；NC组和Control-siRNA组细胞的凋亡率差异无统计学意义(图5)(均P> 0.05)。

A：顺铂作用24 h细胞凋亡率；B：顺铂作用48 h细胞凋亡率；与ERp29-siRNA组比较，*P< 0.05

2.6 细胞周期

经反复实验，我们发现，在以4 μmol/L顺铂处理细胞24 h后，细胞周期的差异较为显著，ERp29-siRNA组细胞的G0/G1、G1/S及G2/M期细胞的比例分别是(55.4±5.1)%、(38.5±4.2)%和(7.4±0.8)%，而Control-siRNA组的比例为(72.5±5.7)%、(23.4±2.6)%和(5.3±0.4)%。从上述数据，我们可以看到，转染ERp29-siRNA后，G0/G1期细胞比例明显降低，与Control-siRNA组相比差异有统计学意义(P< 0.05)；S期及G2/M期细胞比例增加，与Control-siRNA组相比差异均具有统计学意义(均P< 0.05)。NC组和Control-siRNA组之间无统计学差异(P> 0.05)(表1)。

表1 顺铂处理24 h后各组细胞的细胞周期分布

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统三大肿瘤之一，是全球女性妇科癌症死亡的第二大原因，而其病死率则高居榜首[2]。上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常见的病理类型，其占比约为50%～70%。在过去的30年中，所有癌症的5年相对生存率都增加了20%。对于许多癌症来说，存活率的提高很大程度上归功于前沿的研究以及在筛查、手术和治疗方法上的进步。尽管卵巢癌的生存率在过去几十年里也发生了轻微的变化，但即便是在医疗资源丰富的国家，如美国和加拿大，在确诊后患者的5年生存率仅为47%，相比之下，乳腺癌的5年生存率为85%。目前，以铂类和紫杉醇为基础的化疗是卵巢癌除外科手术以外的重要治疗手段，但临床上化疗耐药时常发生，而这也直接导致患者的不良预后。

目前关于ERp29功能及分子作用机制的研究较少，它是一种特殊的内质网蛋白，在真核细胞内质网蛋白分泌中起到至关重要的作用。有研究发现：ERp29调控Connexin43(Cx43)的转运和功能，干扰ERp29功能使内质网中单体Cx43寡聚，导致Cx43在高尔基体中积累增多，减少Cx43向质膜的转运，抑制间隙连接通讯。ERp29也可与单体Cx43形成特异性复合物[3]。既往研究表明，ERp29与某些恶性肿瘤的发生发展呈负相关，如可通过诱导乳腺癌细胞生长停滞而发挥抑癌作用[4]，然而也有报道认为其可促进乳腺癌及胃癌的上皮间质转化[5]。有人提出，其可作为结直肠癌的肿瘤标志物及肿瘤干细胞的分子标记物[6]。关于ERp29与肿瘤放化疗敏感性的相关研究较少，其中，有研究认为其影响乳腺癌放疗敏感性[7]，也有学者提出其可能对化疗敏感性产生影响，如影响乳腺癌细胞对阿霉素敏感性及肺腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性[8-10]。我们的实验结果表明ERp29表达水平影响人卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

目前有关ERp29具体上下游分子调控机制的研究十分有限，有报道认为其与p53、p38 MAPK/XBP-1及c-myc有关[11-13]。Liu等[14]发现：胰岛素抵抗的肝脏细胞在使用右美托咪定(DEX)后，ERp29 mRNA和蛋白水平升高，而p-Akt水平降低。Wu等[15]的实验数据表明，ERp29在胃癌中逆转了EMT过程，其作用与ERK1/2和Akt磷酸化失活有关。

本研究运用免疫组织化学方法检测卵巢癌组织中ERp29的表达情况，结果表明：在化疗耐药和化疗敏感的卵巢癌组织，ERp29的表达存在较为显著的差异。在此基础上，通过siRNA技术特异性干扰人卵巢癌细胞A2780中ERp29 mRNA及蛋白表达水平，随后用不同浓度的顺铂进行处理，CCK-8结果提示：ERp29基因的下调能导致A2780细胞对顺铂化疗敏感性的降低。此后，通过流式细胞分析，我们发现：顺铂处理24 h后，与对照组相比，ERp29-siRNA组G0/G1期细胞比例明显降低，与对照组相比差异有统计学意义(P< 0.05)；S期及G2/M期细胞比例增加，而细胞凋亡率降低。我们推测ERp29可能通过内质网应激等相关途径导致细胞周期的改变，但还需要更多的实验数据来加以证明。

从生物学的角度深入探讨内质网功能可能具有重要的科学意义。内质网在卵巢癌发生发展中的确切作用是什么，哪些内质网组分的改变可能影响卵巢癌对化疗药物敏感性，各组分相互之间作用如何，以上这些问题迫切需要科研工作者进行更加深入细致的研究。只有充分了解肿瘤细胞内在的抵御机制，才能有效发挥药物的杀伤作用，最终为人类恶性肿瘤的防治提供新的策略。