PAFAH1B3介导上皮间质转化促进大细胞肺癌的转移*

汤素萍， 倪松石

南通大学附属医院呼吸与危重症医学科，南通 226001

2018年全球癌症发病率和死亡率的统计显示，肺癌是最常见的肿瘤，占所有癌症病例的11.6%，也是癌症死亡的主要原因，占所有癌症死亡病例的18.4%[1]。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的85%，是肺癌最常见的病理类型。近年来NSCLC的筛查、诊断和治疗方面取得了很大的进展，但NSCLC患者的5年总生存率仍然很低(Ⅳ期患者5年生存率小于10%)[2]。大细胞肺癌(large cell lung cancer，LCLC)是NSCLC中一种较少见的亚型，具有侵袭性，占所有肺癌的9%[3]。肿瘤的快速生长和早期转移是导致LCLC患者预后不良的主要原因[4]。因此，深入地探索LCLC转移的分子机制，寻找新的治疗靶标对LCLC患者至关重要。

血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor acetylhydrolases，PAF-AHs)是一组结构可变的同工酶，分为血浆PAF-AH、细胞内PAF-AH(Ⅰ)和细胞内PAF-AH(Ⅱ)三种类型，血小板活化因子乙酰水解酶1b催化亚基3(platelet activating factor acetylhydrolase 1b catalytic subunit 3，PAFAH1B3)是一个编码PAF-AH(Ⅰ)的α1催化亚基的蛋白编码基因[5]。PAFAH1B3参与了神经发育和精子发生的过程，近年来越来越多的证据表明PAFAH1B3也是致癌调控的关键驱动因素[6]，但PAFAH1B3在LCLC中的功能和作用机制尚未可知。

本研究旨在检测PAFAH1B3在LCLC细胞中的表达，揭示PAFAH1B3对LCLC细胞增殖、侵袭和细胞周期方面的影响，并探讨PAFAH1B3对LCLC细胞侵袭的可能调控机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

肺腺癌细胞系A549、H1299和H1650，LCLC细胞系H460以及人支气管上皮细胞16HBE均来自中国科学院细胞库。肺癌细胞系和16HBE分别置于含有10%胎牛血清(Biological Industries，Israel)、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素(碧云天，中国)的RPMI-1640(Biological Industries，Israel)和DMEM(Biological Industries，Israel)培养液中培养，所有细胞均于含有5% CO2的37℃加湿培养箱中培养。

1.2 蛋白免疫印迹(Western blot)检测

简单来说，从细胞中提取总蛋白，用BCA试剂盒(碧云天，中国)检测总蛋白浓度，将20 μg等量的总蛋白经SDS-PAGE分离，然后转移至0.4 μm的PVDF膜(Millipore，USA)上。膜经过5%脱脂奶粉封闭2 h后，与一抗4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育2 h后再次洗膜，最后ECL发光试剂盒(Biosharp，中国)检测目的蛋白条带，GAPDH为内参蛋白。主要抗体为：PAFAH1B3兔单克隆抗体(1∶1000，ab166906，Abcam)，E-cadherin兔单克隆抗体(1∶10000，ab40772，Abcam)，N-cadherin兔单克隆抗体(1∶5000，ab76011，Abcam)，GAPDH小鼠单克隆抗体(1∶100000，60004-1-Ig，Proteintech)，抗兔二抗(HRP)(Abways Technology，中国)，抗鼠二抗(HRP)(Abways Technology，中国)。

1.3 慢病毒转染及稳转株的建立

以每孔8×104个细胞的密度将H460接种于6孔板中，培养16～24 h。当细胞融合度达到20%～30%时，根据MOI=10加入PAFAH1B3 shRNA病毒(吉凯基因，中国)，并加入Hitrans G P感染增强液，72 h后，继续给予含有嘌呤霉素的RPMI-1640培养液培养细胞，筛选得到稳定沉默PAFAH1B3的H460细胞株，沉默效率经Western blot验证。慢病毒介导的PAFAH1B3 shRNA序列为：shRNA1，5′-GATGGCACCATCAGCCATCAT-3′；shRNA2，5′-CGACAGGTGAACGAGCTGGTA-3′；shRNA3，5′-GCAGGTGACTGGTGGC-ATCAA-3′；shControl，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 CCK8实验

将细胞接种于24孔板中(2000个/孔)，分别于24、48、72和96 h加入CCK8(碧云天，中国)，培养箱中继续培养2 h，以酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.5 克隆形成实验

向6孔板每个孔中接种1000个细胞，每3天更换一次培养液，培养9 d后，吸去培养液，PBS洗2次，然后用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%结晶紫染色5 min，最后用PBS洗3次，并用显微镜拍照，Image J进行计数。

1.6 Transwell侵袭实验

使用Matrigel基质胶(BD Sciences，USA)涂覆于8 μm孔径的Transwell小室(Corning，USA)上室，将H460细胞(5×104个)用200 μL无血清培养液接种于上室，下室加入800 μL含有20%胎牛血清的完全培养液。培养48 h后，用棉签轻轻拭去上室的细胞，经4%多聚甲醛固定细胞、结晶紫染色后，用显微镜在5个随机视野下拍照(×200)，Image J计数细胞。

1.7 流式细胞术

收集6孔板中处于对数生长期的细胞，用预冷的PBS洗涤，然后用预冷的75%乙醇固定2 h。1000× g离心3～5 min，沉淀细胞，小心吸出乙醇，再用PBS洗涤细胞。用含RNase A的碘化丙啶(PI)染色液(美国Everbright®公司)对细胞进行染色，室温避光孵育30 min后，在615 nm发射波长下用流式细胞仪(BD Biosciences，美国)检测，用ModFit LT分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 PAFAH1B3在LCLC细胞中的表达

我们通过Western blot检测了PAFAH1B3在肺腺癌细胞系A549、H1299和H1650，LCLC细胞系H460以及人支气管上皮细胞16HBE中的蛋白表达水平。结果显示，与16HBE细胞相比，PAFAH1B3在A549、H1299、H1650和H460细胞中的表达均显著上调(图1，均P<0.01)。

1：A549；2：H1299；3：H1650；4：H460；5：16HBE；与16HBE比较，**P<0.01

2.2 慢病毒转染H460细胞及稳转株的建立

为了进一步研究PAFAH1B3对LCLC生物学特性的影响，我们用慢病毒介导的shPAFAH1B3(shRNA1、shRNA2、shRNA3)和阴性对照shRNA转染H460细胞，沉默H460细胞中PAFAH1B3，并予嘌呤霉素筛选得到稳定沉默PAFAH1B3的H460细胞株。沉默效率通过Western blot验证，结果显示，与阴性对照组细胞相比，三种shPAFAH1B3转染后，H460细胞中PAFAH1B3蛋白表达水平均显著下降(图2，均P<0.01)。我们选取shRNA2转染后的细胞进行下一步的实验，将其记为shPAFAH1B3，阴性对照组记为shControl，空白对照组记为Parental。

1：shRNA1；2：shRNA2；3：shRNA3；4：shControl；5：Parental；与shControl组比较，**P<0.01

2.3 沉默PAFAH1B3抑制H460细胞的增殖和克隆形成能力

在建立了稳定沉默PAFAH1B3的H460细胞株后，我们进行了CCK-8实验，结果显示，与shControl组细胞相比，shPAFAH1B3组细胞生长速度明显变慢(图3，均P<0.05)，表明沉默PAFAH1B3可显著抑制H460细胞的增殖能力。

与shControl组比较，*P<0.05

克隆形成实验结果显示，shPAFAH1B3组细胞较shControl组细胞形成的克隆显著变小且变少(图4，P<0.01)，表明沉默PAFAH1B3可以显著抑制H460细胞克隆形成的能力。

1：Parental；2：shControl；3：shPAFAH1B3；与shControl组比较，**P<0.01

2.4 沉默PAFAH1B3抑制H460细胞的侵袭能力

为了研究PAFAH1B3缺失后H460细胞侵袭能力的改变，我们进行了Transwell侵袭实验。结果显示，与shControl组细胞相比，shPAFAH1B3组细胞穿过Transwell小室小孔的数目明显减少(图5，P<0.05)，表明沉默PAFAH1B3显著抑制了H460细胞的侵袭能力。

1：Parental；2：shControl；3：shPAFAH1B3；与shControl组比较，*P<0.05

2.5 沉默PAFAH1B3促使H460细胞由S期向G0/G1期转化

我们使用流式细胞术检测PAFAH1B3沉默后LCLC细胞的细胞周期变化，结果显示，沉默PAFAH1B3后，H460细胞中分布于G0/G1期细胞所占百分比显著增多，而分布于S期细胞所占百分比显著减少(图6，均P<0.05)，表明沉默PAFAH1B3可以促使H460细胞的细胞周期由S期向G0/G1期转化，进而抑制了细胞的增殖。

与shControl组比较，*P<0.05

2.6 沉默PAFAH1B3抑制EMT过程

上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在恶性肿瘤的进展中起着关键性的作用，我们进一步研究了PAFAH1B3对EMT过程的调控作用，通过Western blot分析了EMT上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin蛋白表达水平的变化。结果显示，PAFAH1B3缺失的情况下，H460细胞中E-cadherin蛋白表达水平显著上调，N-cadherin蛋白表达水平显著下调(图7，均P<0.01)，表明PAFAH1B3促进了EMT的过程。

1：shPAFAH1B3；2：shControl；3：Parental；与shControl组比较，**P<0.01

3 讨论

在本研究中，我们发现与人支气管上皮细胞相比，PAFAH1B3在LCLC细胞中的表达显著上调。在PAFAH1B3缺失情况下，LCLC细胞生长变慢，克隆形成能力减弱，侵袭能力也受到了抑制。沉默PAFAH1B3引起的LCLC细胞增殖减慢可能与其对细胞周期的抑制有关。此外PAFAH1B3的缺失可以逆转EMT的过程。这些研究结果表明，PAFAH1B3在LCLC中发挥着致癌的作用，它通过调控EMT过程促进了LCLC的进展。

PAFAH1B3通常表达于胎儿脑、胰腺、胸腺、结肠、睾丸组织和红细胞中，PAFAH1B3与PAFAH1 B2在哺乳动物中显示较高的同源性，它们参与了神经发育以及精子发生的过程[6]。PAFAH1B3还可以影响血管生成，Wei等[7]发现在胰岛素刺激下，PAFAH1B3可能被棕榈酰化，抑制棕榈酰化或敲除PAFAH1B3可防止胰岛素诱导的血管生成。Livnat等[8]发现过表达PAFAH1B3可以导致β-catenin表达的减少，提示PAFAH1B3可以作为Wnt信号通路的负调节器；而Wnt信号通路影响了癌症干细胞的维持、转移和免疫调节等过程[9]。有研究发现血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的抑制剂可以促进PAFAH1B3的表达，加速PAF的水解，抑制PAF介导的Caspase-3的激活，强调了PAFAH1B3抗凋亡的作用[10]。

目前PAFAH1B3在人类多种肿瘤中已经有相关的研究，现有结果均提示其在肿瘤中的促瘤作用。例如，通过免疫组化分析证实，下咽鳞状细胞癌组织中PAFAH1B3较癌旁组织表达升高，PAFAH1B3高表达与下咽鳞状细胞癌患者较短的总生存期相关[11]。在乳腺肿瘤中，PAFAH1B3表达水平较正常乳腺组织明显上调，其表达升高明显降低了乳腺癌患者无复发生存率[12]。小干扰RNA沉默PAFAH1B3和药物阻断PAFAH1B3均可抑制乳腺癌细胞的致病性，可以引起广泛的脂质代谢变化，包括具有抗肿瘤和促凋亡作用的肿瘤抑制脂质的增加，如神经酰胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸等[12-13]。Fiedler等[14]还发现PAFAH1B3的丢失可以使白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂治疗显著致敏。

在本研究中，我们观察到沉默PAFAH1B3抑制了LCLC细胞的增殖、克隆形成和侵袭，并可以诱导细胞周期由S期向G0/G1期转化，这些结果说明了PAFAH1B3在LCLC中的促瘤作用，这与先前的研究结果是一致的。

PAFAH1B3的失调影响了LCLC侵袭能力，然而PAFAH1B3参与LCLC转移的确切分子机制尚不清楚。肿瘤转移是一个多步骤的过程，在这个过程中，肿瘤细胞离开原发肿瘤，扩散到远处部位，并形成继发肿瘤[15]。EMT被认为是转移的起始阶段，在肺癌的进展中起着核心作用，靶向EMT信号传导可能是一种新的治疗策略[16]。在EMT过程中，上皮细胞失去其特征，获得侵入性间质表型。EMT发生时，常可以观察到上皮标志物E-cadherin的表达减少，而间质标志物N-cadherin的表达增加[17]。本研究中，我们发现沉默PAFAH1B3可以诱导LCLC细胞中E-cadherin的表达，降低N-cadherin的表达，说明PAFAH1B3是LCLC中EMT的促进因子。E-cadherin是细胞粘附连接的重要组成部分，在细胞粘附和维持上皮细胞表型中起重要作用，E-cadherin表达降低可以导致细胞的粘附丧失，细胞活力增加[18]。本实验中，我们证实了E-cadherin的蛋白表达与PAFAH1B3的表达呈负相关，但E-cadherin下调的机制尚不明确，肿瘤细胞中TGF-β、转录因子(包括Snail、Zeb和Twist)以及microRNA等均可以通过其相应的通路下调E-cadherin的表达[19-21]。我们后续的研究需要进一步探讨PAFAH1B3促进E-cadherin下调的调控机制以及PAFAH1B3在动物模型中的促瘤作用。

综上所述，PAFAH1B3在LCLC中是肿瘤的促进因子，PAFAH1B3通过调控EMT过程促进了LCLC的进展，PAFAH1B3可能是LCLC治疗中一个潜在靶点。