6种非洲猪瘟荧光PCR试剂盒对比试验

彭苗苗，杜丽飞，王 慧，杨 俊，邱美珍，刘伯承，周望平，危 婷

（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131；2.湖南鑫广安农牧股份有限公司,湖南长沙410131）

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一类烈性动物传染病，主要感染动物为家猪、疣猪和野猪[1]。发病特征主要是广泛出血、高热，按照病程长短可分为最急性、急性型、慢性型，最急性型和急性型的发病病程短，死亡率可达100%，我国将非洲猪瘟列为一类动物传染病，也是世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，OIE）法定报告的动物疫病[2]。非洲猪瘟自2018年8月传入中国以来，流行面大而广，给我国的生猪全产业链造成了前所未有的打击和极大的经济损失[3]。我国乃至全世界均未研制出有效的非洲猪瘟商业化疫苗，也没有可靠的治疗药物，目前对于我国的养猪企业和养殖户来说防控非洲猪瘟的有效手段就是做好猪场的生物安全[4]。

养猪场生物安全的核心在于防止外来病原传入猪场，这也是非洲猪瘟防控的核心所在，猪场需要建立严格的生物安全体系，通过对进场的人员、物资、车辆等进行一系列的洗消隔离措施，防止非洲猪瘟病毒被携带进入猪场，同时养殖企业甚至养猪场需要建立可靠的荧光PCR实验室，对受威胁的猪群进行全面严格的主动监测，作为猪场非洲猪瘟疫情预警的一种基本手段，才能做到及时发现疫情，以便采取隔离、扑杀、消毒灯严格的下一步处置措施，防止疫情的进一步扩大[5]；对日常进场的人员、物资、车辆等可能携带非瘟病毒的载体进行采样检测，为科学了解非瘟病毒传入猪场的途径提供依据，做到有的放矢，重点突出；目前市面上商品化的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒品类众多，但检测的灵敏度和准确度却不尽相同，给使用者带来不小的困惑和麻烦。为了解不同厂家的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒检测的灵敏度和稳定性，使用已知浓度的核酸作为标准样品，评估非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒检测的敏感性和一致性，选择一种到两种最优的非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒，以便有目的、有重点地开展相应的猪群监测，制定合理的采样程序，同时也为试剂盒生产厂家改进试剂盒提供参考，我们开展了不同厂家非洲猪瘟荧光PCR试剂盒检测效果的对比试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 非洲猪瘟核酸检测试剂盒：使用5个不同厂家的6种非洲猪瘟核酸检测试剂盒，分别标注为A1、A2、B、C、D、E，具体如表1。

表1 五种不同厂家的非洲猪瘟核酸检测试剂盒

1.1.2 核酸提取试剂盒：使用某品牌DNA核酸手动提取试剂盒

1.1.3 标准阳性核酸样本：本次试验使用已知阳性的核酸样品作为待测样品，经荧光定量PCR试验测定的核酸浓度为3×105copies/mL。

1.1.4 试验仪器：本次对比试验使用的主要仪器如表2。

表2 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 核酸样品梯度稀释：将已知阳性的样品，将其进行10倍的梯度稀释，每管吹打100次混匀，取100、10-1、10-2、10-3、10-45个浓度作为待测样本,分别编号1～5，并设置3个平行重复。

核酸提取：按照试剂盒说明书给出的方法对待测品进行核酸提取。

1.2.2 荧光PCR反应：选取已提取好的核酸样本，每个待测核酸样本设置3个平行重复，并设置空白对照，按照各试剂盒说明书给出的方法和步骤，进行荧光定量PCR反应，具体的反应体系和反应条件如表3。

表3 不同试剂盒的反应体系和反应条件

1.2.3 各对比因素得分计算：对每种对比因素进行排名，并依据排名计算每个试剂盒的得分，最后按各试剂盒的总得分进行最终进行对比排名，以排名最低或最高得6分，随排名升高或降低分别得分54321。（同样排名时取同分，其中对比ct值均值时无ct值的得0分）

2 结果

2.1 试剂盒检测原始结果

从表4和图1可以看出，6种试剂盒均能检测到阳性样品，显示出不同的ct值，且大部分拥有正常荧光曲线，但仍有部分样品的检测虽然有ct值的，没有表现为正常的指数型曲线，依据各试剂盒说明书，判定结果为阴性。

表4 各试剂盒检测ct值记录表

图1 不同试剂盒荧光PCR曲线

2.2 试剂盒检测灵敏度

2.2.1 试剂盒检测出ct值的样品数量（正常荧光曲线）

从图2可以看出，6种试剂盒能够检测出ct值且有正常荧光曲线的样品数量不一，按检出数量由高至低排列依次为试剂盒C（得6分）=试剂盒D（得6分）＞试剂盒A2（得4分）＞试剂盒E（得3分）＞试剂盒B（得1分）=试剂盒A1（得1分）。

图2 各试剂盒检测出ct值的样品数量图（正常荧光曲线）

2.2.2 各试剂盒检出的核酸最低拷贝数

从表5可以看出，6种试剂盒能够检测出的最低核酸拷贝数不一，按检出限度量由低至高排列依次为试剂盒C（得6分）=试剂盒D（得6分）＜试剂盒A2（得4分）＜试剂盒E（得1分）=试剂盒B（得1分）=试剂盒A1（得1分），其中试剂盒C和D在本次对比试验中的检测极限为3×101copies/mL。

表5 各试剂盒检出的核酸最低拷贝数对比

2.2.3 各试剂盒在不同稀释度检出的ct值平均值对比

从表6可以看出，6种试剂盒能够检测出的ct值均值大小不一，经计算，各试剂盒在不同稀释度检出的ct值平均值项的得分分别为试剂盒D（5.6）＞试剂盒C（5.2）＞试剂盒A2（2.4）＞试剂盒E（1.4）＞试剂盒B（0.8）＞试剂盒A1（0.4）。

表6 各试剂盒在不同稀释度检出的ct值平均值对比

综合检出ct值的样品数量、检出的核酸最低拷贝数和不同稀释度检出的ct值平均值三种因素来分析各试剂盒检测非瘟病毒核酸的灵敏度，并计算得分的平均值，可以得出灵敏度得分由高至低的排名为试剂盒D＞试剂盒C＞试剂盒A2＞试剂盒E＞试剂盒B＞试剂盒A1，试剂盒D灵敏度最高，试剂盒C次之，试剂盒A2、E处于居中水平，试剂盒B和试剂盒A1灵敏度最低。2.3试剂盒检测数据一致性

从表7可以看出，6种试剂盒能够检测出的ct值离散度不一，经计算，各试剂盒在不同稀释度检出ct值离散度得分分别为试剂盒D（5）＞试剂盒C（4.8）＞试剂盒A2（3.2）＞试剂盒E（1.2）＞试剂盒B（0.8）=试剂盒A1（0.8）。

表7 各试剂盒同稀释度检测ct值的离散度对比

3 最终对比结果

表8 各试剂盒在不同因素对比时的得分

通过比较6种试剂盒对已知核酸含量标准样品的不同稀释度样品的检测结果发现，试剂盒D和C的检测灵敏性最高，试剂盒A2次之，试剂盒E处于居中水平，试剂盒B和A1灵敏性最低；从检出的ct值离散度来判断各试剂盒检测的一致性，试剂盒D和C的检测一性最好，试剂盒A2次之，试剂盒E处于居中水平，试剂盒B和A1一致性最差。

根据检出ct值的样品数量、检出核酸最低拷贝浓度、检出ct值的平均值和检出ct值的离散度四个维度的得分来综合判断试剂盒，得出的最终结果试剂盒D的灵敏度和一致性最好，试剂盒C得分稍低，但与试剂盒D差距很小，几乎在同一水平，试剂盒A2灵敏度和一致性次之，其余三种试剂盒E＞试剂盒B＞试剂盒A1。

4 讨论

目前我国在市面上流通的商品化非洲猪瘟荧光PCR试剂盒的厂家众多，虽然农业部已经对部分厂家的非瘟荧光试剂盒进行了检测能力评估，但没有提供具体的对比数据，对于养猪企业和散养户来说，他们的检测实验室需要设计标准化的科学实验，从琳琅满目、良莠不齐的众多商品化试剂盒中选择一款或两款检测能力优秀的试剂盒来为实际的防非场景提供依据，由于实际的各种限制，这种评估试验在部分企业尤其是小型养殖场中并不能完成，大多只是在使用时通过主观感受或者简单的数据对比来评估试剂盒的检测效果，本试验从检出ct值的样品数量、检出核酸最低拷贝浓度、检出ct值的平均值和检出ct值的离散度四个维度来评估对6种试剂盒的敏感性和一致性进行数据对比，综合对比6种试剂盒的检测效果。

从最终对比结果可以看出，采用50μL体系的试剂盒C、D、A2相较30μL、25μL体系的试剂盒B、A1和E在灵敏度和一致性具有明显优势，这可能与不同体系加入的样品量及体系中模板含量有关，这与王金良[6]等的研究结论一致；同时可以看出所有试剂盒对高浓度的核酸进行检测时都有较好的一致性，6种试剂盒检测原浓度的核酸（3×105copies/mL）得到的三组ct值的离散度均小于2%，而随着稀释倍数的增加，各试剂盒检出的ct值逐渐升高，并于不同的浓度将ct值提升为可疑区间，所有试剂盒在可疑区间的检测一致性都相对较差，说明对达到试剂盒检测极限前的低浓度核酸进行检测时，所有试剂盒的检测结果都不太稳定，需要更换试剂盒进行一次或多次复检才能得到一个相对可靠的判断结果；在养殖一线的检测中应根据检测目的来选择不同的试剂盒，比如进行普遍的猪群筛查时应优先使用灵敏度较好的试剂盒进行监测，对于可疑结果的复检一般应优先选择一致性好、特异性强的试剂盒。 □