补骨脂对慢性心力衰竭大鼠心肌损伤的影响

庄华梅，陈秀娇，王俊芳，万 杰

慢性心力衰竭是心血管疾病中导致严重疾病甚至死亡的常见疾病。慢性心力衰竭的临床表现多样，具有心室功能不全、心室重构以及异常分布的外周血流等重要特征，主要运用强心、扩张血管、利尿等药物。目前，部分药物能提高心肌收缩力、改善血流动力学等，但存在药物不良反应。现代药理学实验研究表明，益气温阳类药具有强心的功效，而中药补骨脂的来源是豆科植物补骨脂的成熟种子，其性温，味苦、辛，具有补肾壮阳、补脾健胃等作用。补骨脂具有丰富的活性成分，如补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素等[1]，在临床上广泛应用。本实验旨在探讨补骨脂对慢性心力衰竭大鼠超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量以及细胞凋亡相关因子的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级(SPF级)SD大鼠59只，体质量200 g，检疫合格，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.2 药物与试剂 阿霉素(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：Y14M0813)，地高辛[赛诺菲(北京)制药有限公司，批号：140119，规格：每片0.2 mg，购自康佰家药房]，补骨脂(购自莆田市中医院，溶剂提取法制备成中药汤剂)，经福建省莆田市第一医院副主任中药师郑爱群鉴定为正品。RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]，引物合成(Invitrogen)，逆转录酶M-MLV、SYBR Premix Ex TaqTM kit[宝生物工程(大连)有限公司]，苏木精-伊红(HE)染色液(济南雨露生物科技有限公司)，SOD kit(南京建成生物科技有限公司)，MDA kit(南京建成生物科技有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 双目显微镜(日本Olympus)，低温高速冷冻离心机(日本HITACHI)，超微量蛋白核酸分析仪(英国BioDrop)，实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR，美国BIO-RAD)，凝胶成像仪(美国UVP)，紫外-可见分光光度计(日本岛津)。

1.4 实验方法 49只大鼠给予腹腔注射阿霉素溶液建立慢性心力衰竭模型，每周1次，每次4 mg/kg；空白对照组10只大鼠用生理盐水替代给药，8 mL/kg，共注射6周。第6周后，选择慢性心力衰竭模型大鼠10只并解剖心脏，进行病理组织观察，其心肌损伤程度可判断动物模型制作成功。6周后开始灌胃给药，将慢性心力衰竭模型大鼠随机分为模型组、地高辛组和补骨脂组，每组13只。模型组及空白对照组给予生理盐水8 mL/(kg·d)；地高辛组为本实验所设阳性对照，给予地高辛0.1 mg/(kg·d)；补骨脂组给予补骨脂提取液1.04 g/(kg·d)，共7周。

1.5 心肌HE染色 灌胃7周后，将大鼠用水合氯醛麻醉，迅速解剖各组大鼠的左心室组织，放置于4%甲醛溶液中固定，制作石蜡病理切片，用HE染色后中性树胶封片。将石蜡切片置光学显微镜下观察各组心脏组织损伤程度，观察各组大鼠心肌组织形态学改变情况。

1.6 SOD活力的测定 灌胃7周给药结束，切0.1 g大鼠心脏组织于匀浆器中，用生理盐水制成1%的酶液。取1%的酶液0.1 mL与试剂盒中各反应液充分均匀，37 ℃水浴40 min，与2 mL显色剂室温反应10 min。紫外分光光度法，于550 nm波长处，用1 cm光径比色杯，进行比色[测定前用双蒸水(ddH2O)调零]。另设置对照管则不加1%的酶液而是加入等体积的ddH2O，其他处理与测定管处理方式一致。按照说明书上公式计算SOD活力。

1.7 MDA测定 灌胃7周给药结束，制备10%的酶液方法同1.6。空白管加0.2 mL无水乙醇；标准管加10 nmol/mL标准品0.2 mL；样品管及对照管加0.2 mL测试样品。各管中分别加入对应的反应液，95 ℃水浴40 min，冷却后，3 800 r/min离心15 min。吸取反应管中的上层清液，于532 nm处检测其吸光度(测定前用ddH2O调零)。按照说明书上公式计算MDA含量。

1.8 qPCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 mRNA转录水平

1.8.1 RNA提取和逆转录 灌胃7周后，解剖各组大鼠心脏，切取约0.1 g心尖组织用于提取总RNA。采用RNA提取kit(天根公司)获得RNA后，用超微量蛋白核酸分析仪测定其含量，用水平电泳测定RNA纯度。按照M-MLV逆转录酶(宝生公司)操作流程获得cDNA用于qPCR反应的模板。

1.8.2 引物设计与合成 下载GenBank中大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3全长基因序列，设计qPCR引物各两对，经qPCR条件优化后用于qPCR反应，实时荧光定量PCR引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.8.3 qPCR反应 以管家基因GAPDH为内参基因，应用SYBR GreenⅠ染料检测大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3 mRNA转录水平。qPCR反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，cDNA模板2 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL。qPCR反应程序为：95 ℃、10 s，95 ℃、6 s，60 ℃、25 s，Read plate 10 s，40个循环；70 ～95 ℃/0.2 ℃/2 s。选取目的基因表达量较高的1份cDNA，逐级稀释得到5个浓度后，同时扩增管家基因与检测基因，并绘制标准曲线，PCR扩增效率(E)应能在80%～120%为优。应用双标准曲线法[2]换算检测基因mRNA转录水平，即某样品组织中检测基因的转录水平为检测基因定量值除以管家基因定量值。

1.9 统计学处理 采用GraphPad Prism 6统计软件。定量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验或ANOVA分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理组织学观察 空白对照组大鼠心肌细胞分布规律，细胞核完整，细胞浆饱满，细胞间质清晰，细胞膜界限明显，无病变特征。模型组大鼠心肌细胞分布无序，胞膜、胞核等混乱，炎性症状及血管扩张突出，局部有片状溶解。地高辛组大鼠与模型组大鼠比较，心肌纤维分布更有规律，炎症反应较轻，无片状坏死。补骨脂组大鼠与模型组大鼠比较，心肌细胞排列更加规律，无片状肌溶解，有部分炎性症状。详见图1。说明补骨脂汤灌胃给药减轻了阿霉素引起的慢性心力衰竭大鼠心肌组织损害。

图1 各组大鼠心肌组织病理切片图

2.2 各组大鼠心肌组织SOD活力比较 模型组SOD活力较空白对照组下降(P<0.05)；补骨脂组与地高辛组SOD活力较模型组升高(P<0.05)；补骨脂组SOD活力与地高辛组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌组织SOD活力比较(x±s) 单位：U/mg

2.3 各组大鼠心肌组织MDA水平比较 模型组MDA水平较空白对照组升高(P<0.05)；补骨脂组与地高辛组MDA水平较模型组降低(P<0.05)；补骨脂组MDA水平与地高辛组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌组织MDA水平比较(x±s) 单位：nmol/mg

2.4 各组大鼠Bax、Bcl-2 mRNA转录水平比较 与空白对照组相比，模型组Bax mRNA转录水平上调(P<0.05)；与模型组比较，地高辛组与补骨脂组Bax mRNA转录水平均下调(P<0.05)。详见图2。模型组Bcl-2 mRNA转录水平较空白对照组下调(P<0.05)，地高辛组与补骨脂组Bcl-2 mRNA转录水平较模型组上调(P<0.05)。详见图3。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.5 各组大鼠Caspase-9、Caspase-3 mRNA转录水平比较 与空白对照组比较，模型组Caspase-9 mRNA转录水平上调(P<0.05)；与模型组比较，地高辛组与补骨脂组Caspase-9 mRNA转录水平均上调(P<0.05)。详见图4。与空白对照组比较，模型组Caspase-3 mRNA转录水平升高(P<0.05)；地高辛组与补骨脂组Caspase-3 mRNA转录水平较模型组下调(P<0.05)。详见图5。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

与空白对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨 论

阿霉素诱导的慢性心力衰竭的机制还未被全部阐明，其中被很多人认可的一种学说是氧自由基学说，即阿霉素腹腔注射，机体促氧化物/抗氧化物的平衡被打破，促氧化物相对占据优势，破坏了反应平衡，使机体氧自由基堆积，进而使大量心肌细胞死亡，引起严重的心脏功能损害。SOD是抗氧化酶体系中重要的一员，其能够清除自由基，具有高度的还原性，在清除生物体内氧自由基方面有着极其重要的地位，机体损伤程度与SOD水平呈负相关。本研究结果表明，模型组大鼠SOD活力明显降低，提示其心脏损害较严重；空白对照组大鼠SOD活力最高；补骨脂组SOD活力介于模型组与空白对照组之间，提示补骨脂通过提高SOD活力减少氧自由基造成的心脏损害。

MDA含量是组织细胞中脂质过氧化程度的体现，根据MDA水平可以判断细胞的损伤程度，脂质过氧化物含量越高，则组织细胞受损越严重。本研究结果显示，模型组大鼠MDA水平最高，其心肌损伤程度高；而补骨脂组MDA水平较模型组减少，提示补骨脂通过降低 MDA水平改善组织细胞受损情况。

细胞凋亡是一种生理性坏死，一种依赖于信号传导的主动的耗能过程，可清除死亡细胞，形态学上表现为细胞凋亡。在哺乳动物中，最主要的调控因子是Caspase[3]。Caspase家族分为凋亡起始组、凋亡效应组和细胞因子激活组，其中，Caspase-9与Caspase-8为起始因子，通过效应因子Caspase-3来执行细胞凋亡[4]。此外，Caspase-8能水解Bid，水解产物的羧基端片段tBid可激活Caspase-9[5]，有效地放大了凋亡信号。Yao等[6]研究表明，与相邻正常组织相比，Caspase-8和Caspase-3蛋白水平在结肠直肠癌组织中显著上调，且Caspase-8和Caspase-3的高表达与总生存率的降低相关(P<0.05)。另外，有研究发现，Caspase-3在牙原性的肿瘤、根端囊肿、成釉细胞瘤、钙化囊性牙原性的肿瘤等所有病灶中过度表达[7]。Huang等[8]研究366例胃癌病人Caspase-3转录水平与该病症的临床病理参数的相关性。Zhou等[9]研究桑根酮C通过激活Caspase-9和Caspase-3通路，对前列腺癌PC3细胞的生长抑制和凋亡进行剂量依赖性的诱导。Lan等[10]研究缝合压迫诱导的中腭缝合软骨细胞凋亡情况，中腭缝合的凋亡细胞数明显高于对照组，Caspase-3、Caspase-9表达显著增加。Jiao等[11]研究表明，灵芝孢子油可通过激活Caspase-3和Caspase-9诱导乳腺癌细胞凋亡。本研究旨在探讨补骨脂对慢性心力衰竭大鼠心肌损伤过程中Caspase-3、Caspase-9转录水平的影响，以空白对照组大鼠为参照，其余3组大鼠的Caspase-9 mRNA转录水平均上调，提示在心肌损伤中可能存在起始Caspase起动了细胞凋亡进程。以慢性心力衰竭大鼠为参照，地高辛组与补骨脂组大鼠的Caspase-9 mRNA转录水平均上调。在Caspase-3 mRNA的转录调控中，空白对照大鼠转录水平最低，慢性心力衰竭大鼠转录水平最高，而地高辛与补骨脂治疗大鼠的转录水平较慢性心力衰竭大鼠下调，提示补骨脂通过调控Caspase-9与Caspase-3 mRNA转录水平，改善阿霉素诱导的心肌损伤。

Bcl-2和Bax是决定线粒体凋亡途径的重要因子。Bax与Bcl-2均属于Bcl-2家族，Bcl-2家族具有促进凋亡与抑制凋亡的双效作用[12]，其中，促进细胞凋亡作用的是Bax基因，抑制细胞凋亡作用的是Bcl-2基因。张彦清等[13]研究表明，propofol在心肌缺血再灌注中促细胞凋亡，该促进作用可能是通过降低Bcl-2表达和增加Bax表达实现的。Kang等[14]研究肝内胆管癌中mortalin的高表达与Bcl-2表达呈正相关，而Bax表达较低，与恶性肝内胆管癌表型密切相关，可作为肝内胆管癌病人的独立预后指标。有研究分析了鼠尾草醇提取物对小鼠乳腺癌细胞系(4T1)的影响，当Bax表达增加时，Bcl-2表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，鼠尾草提取物的诱导凋亡作用可能是通过Bax/Bcl-2比值增加实现的[15]。参附汤亦是通过降低Bax mRNA转录水平、提高Bcl-2 mRNA转录水平来调节心肌损伤的[16]。本研究中，模型组、地高辛组和补骨脂组大鼠Bax mRNA表达均较空白对照组升高；地高辛与补骨脂治疗慢性心力衰竭大鼠后Bax mRNA转录下调；慢性心力衰竭大鼠Bcl-2 mRNA转录水平最低，应用地高辛与补骨脂治疗的大鼠较慢性心力衰竭大鼠Bcl-2 mRNA转录水平均上调。

综上所述，中药补骨脂可提高SOD活力、降低MDA水平，起到保护心肌的作用，并能明显抑制慢性心力衰竭大鼠心肌损伤，其抑制作用的分子机制可能是通过调控Bcl-2/Bax及Caspase-9和Caspase-3转录水平实现的。