高中生物学PCR技术中“引物”相关问题归类分析

吕爱民 柳 啸

（湖北省监利市监利中学 湖北荆州 433300）

近几年高考试题和模拟题中出现了大量与引物有关的试题，而现有高中生物学教材只提及PCR 技术需要引物。为什么需要引物？引物是什么？引物的作用是什么？引物的碱基序列如何设计？PCR 循环时需要多少引物？如何选择引物和判断引物的互补链？引物与PCR 反应时复性温度的高低和时间长短有什么关系？这些相关问题在教材中并未提及，需要教师对上述相关问题进行归类分析。

笔者在基因工程专题的复习过程中构建了以引物为核心的知识网络图（图1），培养学生学科内知识的综合能力，拓展学生视野，提高学生的科学素养。各个击破相关知识点，夯实学生的基础，加深对引物的理解。利用精选的典型试题，强化巩固知识，提升学生的解题能力。同时从侧面为教师的教学提供参考，提升对教学广度和深度的把控。

图1 “引物”知识网络图

1 引物存在的必要性

1.1 DNA 的复制需要引物 DNA 聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有核酸链的游离3′-羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合，即它需要引物链的存在[1]。引物是一小段DNA 或RNA，它能与DNA 母链的一段碱基互补配对。细胞内DNA 复制以RNA 作引物，从新合成的冈崎片段上发现含有一短暂存在的小的RNA 片段附着在5′端这一事实，可说明DNA 复制时需要RNA引物，这些引物长5～10 bp，现已知RNA 引物的合成是由一种特殊的RNA 合成酶——引物酶所催化的[2]。PCR 反应以DNA 作引物。

例1（2011年江苏卷），请回答基因工程方面的有关问题：PCR 反应体系中含有热稳定DNA 聚合酶，下面的表达式（图2）不能正确反映DNA 聚合酶的功能，这是因为_____。

图2 DNA 聚合酶催化的反应的表达式

答案：DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸连续结合至双链DNA片段的引物链上。

1.2 引物的作用 DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA 链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA 聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA 链。不同的引物可结合不同的目的基因并进行扩增。

例2，请回答基因工程方面的有关问题：

1）若用PCR 技术扩增psy基因和crtI基因，需要分别在不同的PCR 扩增仪中加入__种引物，其作用是________。

2）在利用PCR 技术扩增R（抗旱）或r基因过程中，利用___可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。

答案：1）2；引物与DNA 模板链通过碱基互补配对结合，使DNA 聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸DNA 子链；2）引物。

例3，为研究水稻D基因的功能，研究者将TDNA 插入到D基因中（图3），致使该基因失活，失活后的基因记为d。为验证F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根据D基因、T-DNA 的序列，设计了3 种引物，如图4所示。

图3 将T-DNA 插入到D 基因

图4 3 种引物的碱基序列

随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA 过大，不能完成PCR）。

如果引物“Ⅰ+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为__。

如果_______，则相应植株的基因型为__。

如果_______，则相应植株的基因型为__。

答案：Dd；仅引物“Ⅰ+Ⅲ”组进行PCR 能完成扩增，而“Ⅱ+Ⅲ”组不能完成扩增；dd；仅引物“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR 能完成扩增，而“Ⅰ+Ⅲ”组不能完成扩增；DD。

2 引物的设计

2.1 设计引物的原则 引物是根据目的基因特有的一段已知的核苷酸序列设计合成的，能与目的基因的模板链通过碱基互补配对特异性地结合。

设计引物的主要原则为[1]：①引物长度应大于16 个核苷酸，可防止随机结合；②引物与靶序列间的Tm不应过低；③引物不应有发夹结构，即不能有4 bp 以上的回文序列；④2 个引物间不应有4 bp 以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基；⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C 含量接近50%。

例4，请回答基因工程方面的有关问题：

1）通过PCR 技术可在DNA 分子中专一性扩增出某目的基因，其原因是______。

2）（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题：设计引物是PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的2组引物（图5）都不合理，请分别说明理由。

图5 设计的2组引物部分碱基序列

①第1 组：_____；②第2 组：_____。

3）科研过程中，可用PCR 技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转染后的细胞的全部DNA 分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩增产物中除目的基因外，还有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有______。

①模板受到污染；②退火温度过高；③引物太短；④延伸温度偏低。

答案：1）引物是根据目的基因的一段已知核苷酸序列设计合成的（或引物能与目的基因通过碱基互补配对结合）；2）第1 组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；第2 组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效；3）①③。

2.2 引物的处理 由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等[3]。为了使经PCR 扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。在2种引物的5′端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。

例5（2018年江苏卷），为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1 656 个碱基对），利用基因工程大量制备α-淀粉酶。为了便于扩增的DNA 片段与表达载体连接，需在引物的____端加上限制性酶切位点，且常在2 条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_________。

答案：5′；使DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连。

2.3 引物的特点 综合2.1 和2.2 可知，引物具有以下几个特点：①引物能与DNA 模板通过碱基互补配对结合；②2种引物之间不能互补配对；③某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对；④需要在2 种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列；⑤引物不能太短。

3 PCR 循环时与引物相关的计算

PCR 的原理是DNA 分子的半保留复制，所以要根据DNA 分子的2 条模板链设计2 种引物。PCR 循环时需要的引物数量的计算有2种方法。

方法1：第n次循环产生的DNA 数为2n，根据DNA 分子的半保留复制可知，需要的引物数为2n个，从第1 次循环开始，需要引物的个数依次为2 个、22个、23个……2n个，故PCR 过程经过n次循环，需要的引物总个数是2+22+23+……+2n=2n+1-2。

方法2：PCR 经过n次循环产生的DNA 数为2n，一共有2n+1条链，其中有2条链是DNA 母链，不含引物，其他的每1 条链均含1 个引物，并且2 种引物的数量相等，故PCR 过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n+1-2，需要某一种引物的总个数是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n个DNA 中，一个DNA 由1 条母链和第1 种引物延伸的子链组成，另一个DNA 由另一条母链和第2 种引物延伸的子链组成，其他的DNA 均由2 种引物延伸的2 条子链组成。

例6，通过PCR 方法获得某目的基因，首先需要设计______（填“一对”或“一个”）引物，PCR 过程经过4 次循环，第4 次循环时需要的引物的数量是__个，4次循环一共需要的引物的总数量是____个。

答案：一对；16；30。

例7（2011年江苏卷），请回答基因工程方面的有关问题：利用PCR 技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA 复制类似（图6）。图中引物为单链DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。

图6 PCR 的原理示意图

①从理论上推测，第4 轮循环产物中含有引物A 的DNA 片段所占的比例为____。

②在第___轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA 片段。

答案：①15/16；②三。

4 引物的选择和互补链的判断

DNA 聚合酶只能特异性地复制处于2 个引物之间的DNA 序列，引物5′端的碱基与DNA 母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA 复制的起始点，DNA 子链的合成方向是从引物的5′端向3′端延伸。可利用这一特点判断引物及引物的互补链。

例8（2016年江苏卷），为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，平板上长出的菌落，常用PCR 鉴定，所用的引物组成为图7中的。

图7 引物组成图

答案：引物甲和引物丙。

例9，下图是为了扩增某目的基因所用引物的分布示意图（图8），已知引物组合1 和2、3 和4可扩增相关的目的基因，则引物1、3 与___（填α链或β 链）形成碱基互补配对关系。

图8 引物的分布示意图

答案：β链。

5 引物与PCR 反应时复性温度的高、低和时间长、短的关系

PCR 的每次循环可分为变性（90～95℃）、复性（55～60℃）和延伸（70～75℃）3 步。变性的温度与目的基因中G+C 含量有关；变性时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，变性的时间就越长。复性是让2 种引物通过碱基互补配对与2 条单链DNA 结合，复性的温度与引物中G+C 含量有关，G-C 碱基对间有3 个氢键，A-T 碱基对间只有2 个氢键，引物中G+C 含量较高，复性时温度就较高；复性时间的长短与引物的长短有关，引物越长，复性的时间就越长。延伸的温度不能太高，以防止新合成的子链DNA 与母链DNA 解聚为单链，延伸的温度也不能太低，是为了保证Taq 酶的活性；延伸所需要的时间长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，延伸所需要的时间就越长。

例10（2008年江苏卷），将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。PCR 过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类设定。表1为根据模板设计的2 对引物序列，图9为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。

表1 引物对序列表

图9 引物对与模板结合示意图

答案：引物对B。

例11，请回答PCR 扩增时与退火温度、延伸温度与延伸时间有关的问题：

1）（2018年江苏卷）进行PCR 扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中___的设定与引物有关，___的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）

①变性温度；②退火温度；③延伸温度；④变性时间；⑤退火时间；⑥延伸时间。

2）（2017年江苏卷）PCR 扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏___的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但___的引物需要设定更高的退火温度。

3）（2017年江苏卷）如果PCR 反应得不到任何扩增产物，可采取的改进措施有___（填序号）。

①升高退火温度；②降低退火温度；③重新设计引物。

4）（2021年湖北省元月联考）通过PCR 方法获得eGFP 目的片段，首先需要设计___（填“一对”或“一个”）引物，在体外选择性扩增eGFP 目的片段。PCR 反应一般由95℃热变性、55～60℃引物和模板配对、72℃延伸3个步骤，经过多次循环完成。延伸阶段选用72℃是综合考虑了2个因素，这2 个因素是_____和_____。

答案：1）②；⑥；2）引物与模板；GC 含量高；3）②③；4）一对；防止DNA 变性；保证Taq 酶所需温度条件。

提高能力应以落实基础知识为前提，上述典型例题围绕引物的相关知识点以考查基础知识为首要目标，落实对基本概念的理解，例如，引物应该成对存在、引物5′端与DNA 母链3′端碱基互补配对、DNA 子链只能从引物的3′端开始延伸等；同时对引物的设计与处理、与引物相关的计算及PCR 反应时复性温度的高低和时间长短等知识点，又可考查学生的科学思维和运用知识的能力。“PCR 反应得不到任何扩增产物”或“扩增产物中除目的基因外还有其他不同大小片段的非目的基因片段”引导学生关注引物在PCR 技术中的应用并学会解决科学研究中遇到的问题。教师应该在落实基础知识的同时重视对引物的归纳整理，重视教学提升，锻炼学生的思维，跳出考题。教师应该重视渗透科学、技术、社会相互关系的教育，通过具体事例帮助学生认识生物学与社会发展的紧密联系[4]。引导学生关注科学知识在生活、生产技术中的应用，努力将学生培养成创新型的人才。