外源性透明质酸对人牙周膜细胞增殖及成牙骨质、成纤维分化的影响

金洁琪，光梦凯

（1.首都医科大学附属北京友谊医院口腔科，北京 100050；2.中日友好医院口腔医学中心，北京 100029）

透明质酸（hyaluronan，HA）广泛存在于人体软组织及结缔组织，包括牙周膜组织等的细胞外基质中，其对抗炎、伤口愈合起关键作用，目前临床上应用广泛[1，2]。内源性HA 作为牙周膜组织的重要组成部分，可以抗炎并促血管生成及伤口愈合[3]，而外源性HA 对牙周组织的应用有待进一步研究。人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）有分化潜能[4]，本实验旨在研究在HA 的作用下其增殖及分化的情况，为HA 应用于牙周疾病的治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

细胞为慕尼黑大学牙学院基础实验室自有hPDLCs 细胞系。成骨诱导（osteogenic stimulation，OS）液：FBS，盘尼西林链霉素，地塞米松，L-抗坏血酸，β-甘油磷酸盐，抗坏血酸等（均来自美国Sigma 公司）加入细胞培养液配成。HA 来自Hyalose 公司。查文献后选择分子量3～6Da 的Nano HA 及分子量150K Da 的HA。实验中HA 浓度为20ng/ml[5]。

1.2 实验方法

实验分组：空白对照组（Con）；OS 组（osteogenic stimulation，+OS，阳性对照）；Nano HA 组（+OS+Nano HA）；150K HA组（+OS+150K HA）。

21d 细胞培养：hPDLCs 培养于37℃，5% CO2的恒温箱中，每周换液2 次。每周同一时间对细胞进行显微镜拍照及形态学观察。

细胞增殖WST-1检测：将hPDLCs均匀种在4盒48 孔培养皿中，等待48h，细胞完全附着生长后，标记为起点，分别在第0d，7d，14d，21d 进行细胞增殖测验。WST-1 试剂盒来自Roche 公司，加入培养皿30min后，将细胞进行ELISA测试。

对牙骨质相关的牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP），牙骨质蛋白（cementum protein 1，CEMP1），韧带相关的Scleraxis（SCX），感染相关的Toll 样受体（toll like receptor 4，TLR4）基因进行rt-PCR 检测：将hPDLCs 均匀种在6孔培养皿中，等待48h，细胞完全附着生长后，标记为起点，分别在第0d，3d，7d，21d 刮取细胞，提取RNA，转化为cDNA 后，进行rt-PCR 试验。管家基因选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）。具体基因序列见表1。1.3 统计学方法

表1 rt-PCR检测的标记物的基因序列

应用Prism 8.0 软件进行数据分析。两两比较采用t检验，组间比较采用one-way ANOVA。

2 结果

2.1 hPDLCs21d细胞培养的形态学观察

由图1（见封二）可见，A 组空白对照组中hPDLCs 呈梭形生长，随着培养时间的增加，集落逐渐融合，细胞均匀聚集分布，培养后期细胞逐渐经纬状交叠，细胞形态尖锐，边缘伸展（图A1～A3）。C 组为Nano HA 组（图C1～C3），D 组为150K HA组（图D1～D3），细胞形态均较空白对照组较为圆钝，边缘收缩，细胞培养后期（21d）时尤为明显。B 组为成骨诱导的阳性对照组OS 组（图B1～B3），hPDLCs 形态介于空白对照组及HA 组之间，较空白对照组圆钝，但细胞收缩程度不如HA组明显。

图1 hPDLCs培养7d、14d、21d时显微镜下观察照片（×10）

2.2 HA抑制hPDLCs增殖

实验初期，各组细胞生长速度接近，组内无统计学差异。从第7d 开始，空白对照组显著高于OS 组及150K HA 组（P＜0.01）；OS 组显著高于Nano HA 组（P=0.0009）。第14d 时，hPDLCs 增殖速度空白对照组＞OS 组＞Nano HA 组＞150K HA 组。第21d 时，空白对照组增速显著高于Nano HA 组及150K HA组（P＜0.01）；OS组细胞增殖速度亦显著高于Nano HA 组及150K HA 组（P=0.0398，P=0.0057）。Nano HA 与150K HA 两组之间细胞增殖速度无明显差异。综合看来HA 对hPDLCs 增殖明显有抑制作用，见图2。

图2 PDLCs WST-1增殖实验

2.3 HA抑制hPDLCs表达CAP

图3A 示，7d 时4 个组的CAP 表达均达到高峰，而21d 时回落至初始线以下。3d 时可见空白对照组比OS，Nano HA 组及150K HA 组都高（P＜0.01）；OS 组亦高于150K HA 组（P=0.0191），可见150K HA 对CAP 表达有抑制作用。7d 时2 个HA组CAP 表达亦低于空白对照和OS 组，Nano HA组更是低于150K HA 组（P=0.0103）。21d 时，HA组的CAP表达亦低于空白对照组，而与OS组无统计学差异。总之HA 基本上抑制hPDLCs 表达CAP。

2.4 HA抑制hPDLCs表达CEMP1

图3B 示，HA 刺激下，hPDLCs 中CEMP1 的表达与CAP 类似，7d 时均有较高的表达，21d 时回落。3d 时，HA 对CEMP1 的表达有抑制作用，HA组均低于空白对照组和OS 组。7d 时，空白对照组最高，而OS 组，Nano HA 组及150K HA 组内无明显差异。21d 时，Nano HA 组与空白对照组的CEMP1 表达无明显差异；而空白对照组的表达高于OS组及150K HA组（P=0.0036，P=0.0004）；Nano HA 组的CEMP1 表达亦高于150K HA 组（P=0.0375）。总之HA，尤其是150K HA抑制hPDLCs表达CEMP1。

2.5 150K HA先促进后抑制hPDLCs表达SCX

图3C 示，hPDLCs 的表达量很低。前3d 各组之间SCX的表达差异无统计学意义。7d时，OS组和150K HA 组的SCX 表达显著高于空白对照组，亦显著高于Nano HA 组（均P＜0.01）。21d 时，空白对照组SCX 表达升高，而150K HA 组表达降低，显著低于空白对照组，P=0.004）。

图3 hPDLCs rt-PCR 中CAP、CEMP1、SCX的表达

2.6 HA促进hPDLCs表达TLR4

图4 示，前期hPDLCs 的TLR4 表达在较低水平，而在21d 时显著提升。3d 时HA 组TLR4 表达显著高于空白对照组及OS组；Nano HA组亦高于150K HA 组（P=0.0378）。7d 时各组表达均高于空白对照组，而150K HA 组则低于OS 及Nano HA 组（P=0.0461，P=0.0132）。21d 时各组高于空白对照组，而OS 组、Nano HA 组及150K HA 组之间差异无统计学意义。总之，HA 尤其是Nano HA，促进hPDLCs表达TLR4。

图4 hPDLCs rt-PCR 中TLR4的表达

3 讨论

本实验细胞形态学观察中，在Nano HA 和150K HA 刺激下，hPDLCs 形态较空白对照组明显圆钝；印证了Al-Rekabi等学者的研究成果：HA可提高hPDLCs 的收缩性，且降低其细胞迁移能力。该实验中，HA 刺激下的hPDLCs 形态较对照组明显收缩[6]。HA 对大部分细胞有抑制增殖的作用[7]，在本实验中亦得到了验证。不过也有学者研究发现HA 可以促进PDL 细胞增殖[8]，其观测时间为细胞种植后的3d 和5d，与本实验不同；且使用的HA 分子量未知，而HA 对细胞的作用与HA的分子量相关，因此与本实验结论相悖。

牙周附着丧失是牙周炎症的重要表现。CAP和CEMP1 是牙周附着及牙骨质相关蛋白[9]。hPDLCs是具有分化潜能的细胞，在适当的诱导下可以分化为成牙骨质细胞[10]。可惜在本实验中，2种HA 都对hPDLCs 的成牙骨质分化起抑制作用。7d 时所有组CAP 及CEMP1 表达均升高而在21d回落，HA 组表达CAP 均低于空白对照组，但无统计学差别；21d 时150K HA 明显抑制CEMP1 表达。SCX 是调节成纤维细胞形成纤维组织的蛋白，可以促上皮细胞向间充质细胞转化，对组织愈合纤维形成起关键作用[11]。此外SCX还可以机械压力下促进腱细胞转化和增殖，从而修复肌腱[12]。本实验发现150K HA 在7d 可促进SCX 表达，而在21d 时抑制hPDLCs 表达SCX。考虑到牙周组织承受各种咀嚼压力，因此很有必要进一步研究HA 对SCX 的调节作用。TLR4 是炎症相关因子，炎症状态下可激活组织免疫反应[13]。TLR4 还可以调节hPDLCs 的成骨分化[14]。本实验中，2 种HA，尤其是Nano HA，在3d 可明显促进hPDLCs表达TLR4，21d 时OS 组与HA 组间无差异，但亦均明显高于空白对照组。HA 可诱导受损组织中成纤维细胞和角质细胞分化以修复受损伤的组织[15]。此外HA 还可以诱导软骨、韧带的修复及hPDLCs 神经方向的分化[16，17]，且可以促进hPDLCs早期成骨分化[8]。有学者在老鼠牙周炎模型上使用了HA 凝胶，得到很好的骨再生[18]。因此HA在牙周炎患者的临床应用还是很有前景。