结核性溃疡患者血浆CXCL9、CXCL10水平分析及临床意义*

李鑫，徐卫平，臧莹，钱佳燕，黄子慧(南京市中西医结合医院.检验科，.瘰疬科，南京 210014)

结核性溃疡是指结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)、牛分枝杆菌、卡介苗等经各种传播路径侵犯机体局部组织[1]，引起病灶周围软组织、皮下及皮肤的坏死，最终液化破溃所形成的创面，为肺外结核的一种，是临床常见的一种特异性感染性创面[2]。其在临床上与某些慢性难愈性创面表现极为相似，难以鉴别，目前尚未发现诊断结核性溃疡具有较高特异性、灵敏度及快捷方便的检测指标及检测手段[3]。

分枝杆菌主要感染机体的免疫防御细胞，在机体内复制与传播，而免疫防御细胞的募集在很大程度上取决于趋化因子的释放。其中趋化因子(C-X-C基序)配体9(C-X-C motif chemokine 9，CXCL9)、趋化因子(C-X-C基序)配体10(C-X-C motif chemokine 10，CXCL10)主要对单核细胞和淋巴细胞等具有趋向作用。已有研究表明，CXCL9、CXCL10与结核相关疾病的发生相关，是结核特异性反应介导炎症的重要介质[4-7]，在治疗反应、基因调控和疾病转归中发挥着重要作用[8]。本研究基于定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)技术快速检测结核性溃疡、非结核性溃疡患者及健康人体内血浆CXCL9、CXCL10的表达情况，评价CXCL9、CXCL10在结核性溃疡患者中的诊断效能。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2018年—2020年南京中医药大学附属南京市中西医结合医院瘰疬科结核性溃疡患者108例，男41例，女67例，年龄(43.45±17.23)岁，纳入结核性溃疡组。结核性溃疡诊断参照《现代结核病学》[9]和《常见疾病的诊断与疗效判定(标准)》[10]的有关标准：脓肿破溃后脓液稀薄，夹有败絮样物，疮口潜行，久不愈合；组织病理证实为结核病，或脓液涂片找到抗酸杆菌；可有肺结核病史或接触史；伴有低热、盗汗、神疲、乏力、消瘦等全身症状。另收集同期非结核性溃疡患者27例，包括压力性溃疡5例，下肢静脉性溃疡6例，糖尿病足6例，皮肤和软组织感染6例和烧伤患者4例，男12例，女15例，年龄(46.31±14.23)岁，纳入疾病对照组，既往无结核病病史及接触史。发病部位均在躯干、四肢，溃疡面积4～16 cm2，窦道长度2～4 cm。收集同期健康人36例(来自医院体检中心)，男16例，女20例，年龄(41.28±11.47)岁，纳入健康人对照组，既往无结核病病史及接触史，皮肤表面无溃疡创面。以上入组对象皆符合排除标准：(1)合并有造血系统、肝、肾及心脑血管等严重原发性疾病及继发疾病者；(2)妊娠或哺乳期妇女；(3)精神病患者；(4)免疫功能受损者(有症状的HIV感染、已确诊或疑似的HIV感染、白血病、淋巴瘤或全身性恶性疾病等)；(5)活动性肺结核患者。3组间年龄、性别分布差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过南京市中西医结合医院伦理委员会伦理审查(文件批号：201901001)，所有纳入患者均为自愿参与并签署书面知情同意书。

1.2样本采集 采集2 mL全血样本放入EDTA抗凝管中，在2 h内4 ℃、2 500 r/min离心5 min，取上层血浆样本放入1.5 mL EP管中并置于4 ℃保存。

1.3主要仪器与试剂 LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)；2720 thermal cycler普通PCR仪(Life technologies公司)。TRIzolTMLS试剂(Thermo Fisher Scientific公司，批号10296010)；PrimeScriptTMPT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa公司，批号RR036A)；ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix (Without ROX)试剂盒(南京诺唯赞公司，批号Q321-02)。

1.4方法

1.4.1RNA提取及逆转录反应 血浆总RNA的提取采用TRIzolTMLS试剂，按试剂说明书进行。使用核酸测定仪检测各样本RNA浓度，配制逆转录反应液10 μL，包括5×PrimeScript RT Master Mix(Pertect Real Time)2 μL，RNA样本<500 ng，加RNase Free dH2O至10 μL，轻柔混匀后在普通PCR仪进行逆转录反应，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。

1.4.2PCR引物设计与合成 根据GenBank公布的人CXCL9基因(登录号：BC063122.1，基因序列如SEQ ID NO.1所示)和人CXCL10基因(登录号：BC010954.1，基因序列如SEQ ID NO.2所示)的编码序列，用Primer Premier软件设计RT-qPCR扩增引物，以U6为内参基因，由上海生工生物工程公司合成。引物序列见表1。

表1 定量PCR检测引物

1.4.3定量PCR检测 反应体系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Without ROX)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板cDNA 0.1 μL，dd H2O 4.1 μL。以CXCL9为引物时，反应条件为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s、56 ℃ 24 s、72 ℃ 15 s，35个循环；50 ℃延伸30 s获得荧光。以CXCL10为引物时，反应条件为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 24 s，72 ℃ 15 s，35个循环；50 ℃延伸30 s获得荧光。每个样品一式2份进行测试。由于内参U6很稳定，在以上2个条件下无区别，故根据同孔板研究对象设置。通过2-△Ct法分析各组中CXCL9、CXCL10的相对表达水平。实验组△Ct=实验组的Ct值-内参基因U6的Ct值。

2 结果

2.1血浆中CXCL9和CXCL10mRNA的相对表达水平 与对照组(0.40±0.01，1.18±0.29)相比，疾病组患者的CXCL9、CXCL10mRNA表达水平明显升高(1.43±0.36，12.53±6.18)，差异有统计学意义(t分别为5.954、5.421，P均<0.000 1)。

2.2ROC曲线分析 CXCL9、CXCL10 诊断结核性溃疡的AUC为0.938和0.915，见图1。当CXCL9、CXCL10的cut off值分别为0.220、4.232时，2个趋化因子组合对结核性溃疡的敏感性、特异性分别为92.6%、77.8%。见表2。

表2 CXCL9和CXCL10诊断结核性溃疡的效能

图1 CXCL9(A)和CXCL10(B)的ROC曲线分析

3 讨论

本次研究非结核性溃疡患者包括压力性溃疡、下肢静脉性溃疡、糖尿病足、皮肤和软组织感染和烧伤患者。在临床上，可根据患者的病史和临床表现予以鉴别诊断。但是，在疾病晚期、机体免疫低下、伤口暴露情况下，易感结核杆菌，往往临床诊断困难，延误治疗。故本次研究将非结核性溃疡患者作为对照组之一。经数据分析后发现，与对照组相比，结核性溃疡患者血浆中CXCL9、CXCL10呈高表达状态，说明机体内CXCL9与CXCL10的表达受MTB影响。ROC曲线分析发现，两组基因的AUC值均大于0.9，表明辅助诊断结核性溃疡效果佳。以cut off值为临界值，单独使用CXCL9检测或CXCL10检测均可诊断结核性溃疡疾病，但采用CXCL9和CXCL10联合检测的灵敏度更高，判断检测效果更好。由于实验条件的限制，此次研究样本量较少，未深入验证相关趋化因子在治疗反应、基因调控和疾病转归等方面的表现及作用，有待进一步补充病例研究。