非瓣膜性心房颤动患者ABCB1和CES1基因多态性对达比加群酯抗凝疗效的影响

郑绪雅，张琳，张俊峰(.郑州大学第五附属医院检验科，郑州450052；2.郑州大学医学科学院，郑州450052)

非瓣膜性心房颤动(non-valvular atrial fibrillation，NVAF)简称非瓣膜性房颤，主要是指没有风湿性二尖瓣狭窄、机械或生物瓣膜置换、二尖瓣修复等情况下发生的心律失常，是临床上常见的房颤类型。房颤患者经过规律抗凝治疗后，其脑卒中风险显著降低[1]。达比加群酯(dabigatran etexilate)是一种新型口服抗凝药，但其本身是小分子的前体药物，不具备药理活性作用，可作为药物外排泵P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的底物，在肠道吸收后经羧酸酯酶1(carboxylesterases，CES1)水解，转化为活性代谢产物达比加群(dabigatran)，并与凝血酶的特异性位点结合，抑制凝血酶活性、阻止纤维蛋白形成以发挥抗凝作用[2]。然而，由于药代动力学存在个体间差异，服用达比加群酯治疗的非瓣膜性房颤患者有时会发生出血或血栓等不良临床事件。Sychev等[3]研究发现ABCB1SNP rs1045642与达比加群峰浓度相关，携带次要等位基因的患者具有更高的血药浓度峰值和出血风险。但也有研究表明SNP rs1045642多态性与达比加群酯药代动力学无关[4-5]。有文献报道称CES1SNP rs2244613的次要等位基因会降低患者血药浓度谷值[6-7]，出血风险也随之下降。Shi等[8]认为SNP rs2244613与血药浓度和临床结果均无关。由此可见，关于基因多态性位点对达比加群酯抗凝有效性和安全性的影响目前仍然没有统一的说法，而之前的相关研究主要是针对欧洲人群。因此，本研究通过检测我国非瓣膜性房颤患者ABCB1和CES1基因多态性的分布，初步探讨非瓣膜性房颤患者基因多态性与达比加群酯治疗效果的关系，以期为临床上达比加群酯的个体化用药提供理论指导和参考依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2020年5月至2021年6月在郑州大学第五附属医院心内科治疗的非瓣膜性房颤患者80例作为研究对象，其中男43例,女37例，年龄(64.5±8.6)岁。纳入标准:年龄≥18岁，连续服用达比加群酯(每次110 mg，每天2次)≥3 d，CHA2DS2-VASC评分≥2分、HAS-BLED评分≤3分的非瓣膜性房颤患者,其中CHA2DS2-VASC评分内容为充血性心力衰竭/左心室功能障碍(C)1分，高血压(H)1分，年龄(A)≥75岁2分，糖尿病(D)1分，脑卒中/TIA/血栓栓塞病史(S)2分，血管疾病(V)1分，年龄65～74岁(A)1分，女性(SC)1分，分值越高卒中风险越大;HAS-BLED评分内容为高血压(H)1分，肝肾功能异常(A)1分，脑卒中(S)1或2分，出血(B)1分，INR值易波动(L)1分，老年(E)1分(如年龄>65岁)，药物或嗜酒(D)1分，分值越高出血风险越大。符合非瓣膜性房颤诊断标准:经过心电图证实为房颤，经过超声心动图检查排除瓣膜性心脏病，并且观察48 h以上房颤不可自行终止。排除标准：(1)存在人工心脏瓣膜或血流动力学意义重大的瓣膜疾病；(2)经食道超声心动图检查发现心房或心房附件有血栓；(3)严重肝肾功能损害；(4)有明显出血风险的合并症，如消化性溃疡和血小板减少症，或临床活动性出血；(5)同时使用任何抗凝剂、抗血小板药物或强P-gp抑制剂，如酮康唑、伊曲康唑、环孢霉素和决耐达隆；(6)不遵守达比加群酯的规定用法，如改变服用剂量或给药间隔。本研究获得本院医学伦理委员会批准(批准号为Y2021027)，并获得了研究对象的书面知情同意。

1.2标本采集与处理 至少连续服用达比加群酯3 d后用枸橼酸钠抗凝采血管采集患者外周静脉血以检测血浆浓度和凝血指标。用乙二胺四乙酸盐抗凝采血管采集患者外周静脉血来提取DNA，以分析基因多态性。

1.3主要仪器与试剂 ACL TOP 700凝血分析仪(西班牙Werfen公司)，ABI 7500核酸扩增仪(美国应用生物系统公司)，DNA提取试剂盒(批号DP348，北京天根公司)，TaqMan®SNP基因型分析试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);凝血四项配套试剂、Hemoclot凝血酶抑制因子(法国Hyphen-BioMed公司)。

1.4血浆浓度测定与凝血指标检测 用前一次给药后10～16 h采集的血液样本检测达比加群血浆谷浓度水平，给药后1～3 h的标本检测血浆峰浓度水平。3 000×g离心15 min收集血浆标本，通过发色底物显色分析方法定量测定达比加群血浆浓度[9]。-20 ℃下保存的血浆样本可以在2个月内完成达比加群浓度的测定。在取样后2 h内进行凝血功能检测，主要包括活化部分凝血活酶时间(APTT)与凝血酶时间(TT)等凝血指标。凝血试验在全自动凝血分析仪上进行。每项测试运行2次，并用测试结果平均值进行后续分析。

1.5基因型检测 用DNA提取试剂盒从全血标本中提取DNA，按照TaqMan®SNP基因型分析试剂盒说明书配制PCR反应体系。在ABI 7500核酸扩增仪上进行核酸扩增以检测ABCB1SNP rs1045642与CES1SNP rs2244613的基因多态性，反应程序:95 ℃温育3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，以同样的方式重复50个循环。对CES1SNP rs2244613进行基因型检测的PCR反应程序：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，然后56 ℃退火1 min,39个循环。

1.6观察临床不良事件 在治疗期间观察并记录临床不良事件的发生率，分析不同基因型的患者服用达比加群酯后的抗凝有效性和安全性，不良临床事件包括治疗后出现的血栓性疾病(心肌梗死、卒中)、死亡等。出血事件包括轻微出血(皮肤瘀斑、鼻出血、牙龈出血、尿潜血等)、少量出血(咯血、呕血、肉眼血尿、血便)、大量出血(出血量达300 mL伴Hb下降20 g/L或者关键器官发生出血，如颅内、椎管内、腹膜后等)、致死性出血(Hb至少下降50 g/L，需要输血4个单位及以上的出血或者必须外科手术治疗的出血)。

2 结果

2.1一般临床资料 收集研究对象的基线资料，其人口统计学和临床特征见表1。

表1 患者的一般临床资料

2.2基因型分布及等位基因频率 80例非瓣膜性房颤患者基因型分布见表2。ABCB1SNP rs1045642检测出CC、CT、TT 3种基因型，CES1SNP rs2244613检测出AA、AC、CC 3种基因型，所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 非瓣膜性房颤患者ABCB1与CES1基因型分布以及等位基因频率

2.3ABCB1和CES1多态性对达比加群血浆浓度的影响 见表3。对于ABCB1SNP rs1045642，达比加群峰浓度的最高值为273.73 ng/mL，峰浓度的最低值为104.26 ng/mL，不同基因型组间峰浓度比较，差异无统计学意义(P=0.124)；达比加群谷浓度的最高值为38.99 ng/mL，谷浓度的最低值为2.88 ng/mL，不同基因型组间谷浓度差异无统计学意义(P=0.053)。对于CES1SNP rs2244613，达比加群峰浓度的最高值为214.36 ng/mL，峰浓度的最低值为107.22 ng/mL，不同基因型组的峰浓度差异无统计学意义(P=0.097)；达比加群谷浓度AA基因型患者最高，AC基因型患者次之，CC基因型患者人群最低(P<0.001)，达比加群谷浓度的最高值为50.41 ng/mL，谷浓度的最低值为6.90 ng/mL。

表3 不同基因型的非瓣膜性房颤患者服用达比加群酯后的血药浓度(ng/mL)

2.4ABCB1和CES1多态性对凝血指标的影响 由于峰浓度水平的TT会超过检测上线，所以只在谷浓度水平下测定TT。如表4所示，研究的所有基因型均未影响峰浓度水平的APTT值。对于ABCB1SNP rs1045642位点，3种基因型与谷浓度水平APTT无关(P=0.348)，与TT也无关(P=0.271)。对于CES1SNP rs2244613位点，3种基因型具有不同的谷浓度水平APTT值与TT值。AA基因型患者人群具有最高的谷浓度时期APTT值，最高值为42.21 s。CC基因型患者人群具有最低的谷浓度时期APTT值，最低值为27.31 s。继续分析发现与AA基因型或AC基因型患者相比，CC基因型患者的谷浓度水平的APTT更低(P=0.046)。谷浓度水平的TT最高值为141.32 s，谷浓度水平的TT最低值为31.62 s。进一步分析发现，与AA基因型或AC基因型患者相比，CC基因型患者的谷浓度水平的TT更低(P=0.043)。

表4 不同基因型的非瓣膜房颤患者服用达比加群酯后不同时期的凝血指标变化(s)

2.5ABCB1和CES1多态性对出血发生率的影响 不同基因型患者出血情况见表5。在本研究中，80例患者中没有出现心肌梗死、短暂性脑缺血或脑卒中等血栓事件，其中有20例发生了不同程度的出血，无大出血病例，出血类型主要是轻微出血和少量出血。比较ABCB1与CES1不同基因型的患者出血情况，ABCB1SNP rs1045642位点，当患者为CC型时，出血发生率为11.4%，当患者为TT基因型时，出血率为12.5%，每一个次要等位基因T与降低出血风险趋势相关，但是组间比较差异无统计学意义[CC vs CT vs TT:11.4%(4/35) vs 13.5%(5/37)vs 12.5%(1/8)，P=0.452]。CES1SNP rs2244613与临床出血事件的发生有着显著的相关性，CC基因型的患者出血发生率最低为10.0%，CT基因型的患者出血发生率为16.6%，TT基因型的患者出血发生率最高为20.6%，并且组间差异有统计学意义[AA vs AC vs CC：20.6%(7/34) vs 16.6%(6/36) vs 10.0%(1/10)，P=0.035]。

表5 非瓣膜性房颤患者单核苷酸多态性与达比加群酯治疗后出血事件的关系

3 讨论

达比加群酯是2008年经欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)第一个被批准上市的新型口服抗凝药，此后在2013年获得我国食品药品管理局批准上市。达比加群酯治疗窗口宽、不需频繁监测凝血指标、体内代谢过程不易受食物影响，与传统的口服抗凝剂华法林相比，可以在一定程度上增强抗凝效果。遗传因素可影响达比加群酯的药代动力学与药效学。ABCB1SNP rs1045642与CES1SNP rs2244613基因多态性研究较为广泛。

人ABCB1基因位于7号染色体，其表达产物主要为P-gp蛋白又称ATP结合盒转运蛋白B1(ATP-binding cassette transporter B1)，是一种依赖三磷酸腺苷(ATP)的外排转运蛋白[10]。P-gp蛋白主要分布在具有排泄功能的人体组织中，例如肠、肝、肾上皮细胞膜以及内皮细胞，它具有血-组织屏障的作用，保护机体组织(如大脑、胎儿和睾丸)免受有毒外来物质的伤害，限制药物从肠腔吸收[10]。本研究检测结果显示，纳入研究的非瓣膜性房颤患者在SNP rs1045642位点上有2个等位基因和3组基因型，次要等为基因频率(T)为33.1%。不同基因型之间的达比加群血浆浓度与临床出血事件的发生率差异无统计学意义，提示ABCB1SNP rs1045642对达比加群酯抗凝效果没有产生太大的影响，此位点基因多态性不是临床出血结果的决定性因素。这与Gouin-Thibault等[4]研究得出的结论较为一致。此外，在本研究中ABCB1SNP rs1045642的基因型与凝血指标APTT、TT均无显著性相关。这与国内学者薄雅坤等[11]的研究结果相反，其将患者rs1045642位点基因型分为CC基因型组、TT基因型组和CT基因型组，比较分析不同基因型的患者经过达比加群酯治疗后血药浓度与凝血指标的差异。随后发现TT基因型相比于CC基因型具有更高的血药峰浓度和出血风险，并且TT基因型组患者凝血指标APTT与TT值明显高于CC基因型组。上述研究结果出现明显差异的原因可能是本研究纳入的样本数量太少，也可能因为浓度测量方法和凝血试验试剂的不同导致实验结论不一致。

人CES1基因位于16号染色体，编码产物羧酸酯酶1主要功能是促进达比加群酯转化代谢为有活性的达比加群，广泛分布于肝脏、单核巨噬细胞和肺泡上皮细胞。CES1基因的遗传变异可以调节或者改变达比加群酯的药代动力学[12]。CES1SNP rs2244613位点的基因多态性可改变羧酸酯酶1的活性。羧酸酯酶1在体内的活性和功能存在个体性差异，进而影响达比加群酯在体内转化成具有药理活性的达比加群，因此抗凝效果具有个体性差异。在本研究中，非瓣膜性房颤患者CES1SNP rs2244613基因多态性可分为3种基因型，次要等为基因(C)的频率为35.0%。比较不同基因型的达比加群血浆浓度时发现CES1SNP rs2244613多态性与谷浓度呈显著相关，AA基因型患者的谷浓度水平最高、AC基因型患者次之、CC基因型患者最低。与之相关的是，CC基因型患者临床出血发生率明显低于AA基因型患者、AC基因型患者。这些结果可以表明次要等位基因(C)能够降低谷浓度、减少出血风险，CES1SNP rs2244613基因多态性可以影响非瓣膜性房颤患者服用达比加群酯的抗凝效果。Paré等[13]在RY-LY试验中也得到相似的结论，其研究指出与未携带次要等位基因的患者相比，携带1个次要等位基因(C)的患者谷值下降约15%，携带2个次要等位基因的患者血药浓度较未携带者血药浓度谷值下降约28%，并且此位点遗传效应大于剂量效应，是临床结局的决定因素。此外，本研究还同时分析CES1SNP rs2244613基因多态性与凝血指标的关系，结果显示CC基因型患者谷浓度水平的APTT与TT均低于AA基因型，说明次要等位基因(C)影响谷浓度水平的凝血指标。Liu等[14]也认为rs2244613影响谷浓度TT，等位基因(A)显著延长TT值。据报道达比加群血药浓度与APTT、TT呈正相关[15-16]，推测CC基因型患者的APTT和TT显著低于AA基因型患者可能是因为CC基因型患者血药浓度显著低于AA型患者，即患者ABCB1基因多态性通过改变达比加群酯药代动力学来影响凝血功能，进而影响出血或血栓事件的发生。这也提示AA基因型患者可以通过APTT或TT来监测血药浓度，及时调整服用剂量减少临床不良事件发生率。

综上所述，ABCB1基因多态性可能对达比加群酯抗凝治疗效果无明显影响，遗传因素的作用有待进一步认识。CES1SNP rs2244613上的次要等位基因(C)可以降低血药浓度谷值与APTT和TT，并且降低轻微出血风险。通过分析患者的CES1SNP rs2244613基因多态性可能有助于指导临床调整抗凝治疗方案以及达比加群酯的合理安全用药，对降低不良事件的发生大有裨益，从而推进临床的个体化治疗发展。