咪喹莫特调节Th1、Th2细胞相关趋化因子对兔耳增生性瘢痕创面愈合和瘢痕增生的影响

陈方

[摘要]目的：探讨咪喹莫特调节Th1、Th2细胞相关趋化因子对兔耳增生性瘢痕创面愈合时间和瘢痕增生的影响。方法：选取健康清洁级新西兰大耳实验兔40只，随机分为空白组、模型组、凡士林组以及咪喹莫特组，每组10只。模型组、凡士林组以及咪喹莫特组建立兔耳瘢痕模型，14d创面完全上皮化后，凡士林组涂抹凡士林软膏0.1g，1次/d；咪喹莫特组外用咪喹莫特软膏0.1g，1次/d，连续42d。观察并比较各组实验兔的大体情况，瘢痕增生指数，Th1、Th2 细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平，完全上皮化时间及创面愈合时间。结果：模型组与凡士林组28d达到增生巅峰；与模型组相比，凡士林组及咪喹莫特组的瘢痕增生指数、创面愈合时间均較低，且咪喹莫特组低于凡士林组，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，凡士林组及咪喹莫特组的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平较低，CXCL10、CXCL12水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与凡士林组相比，咪喹莫特组的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平降低，CXCL10、CXCL12水平较高（P<0.05）。三组实验兔完全上皮化时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：咪喹莫特能够调节Th1、Th2细胞相关趋化因子，缩短兔耳增生性瘢痕创面的愈合时间。

[关键词]咪喹莫特；趋化因子；兔耳瘢痕模型；创面愈合时间；增生性瘢痕

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）03-0100-04

Effect of Imiquimod Regulating Th1 and Th2 Cell-associated Chemokines on Wound Healing and Scar Proliferation in Rabbits

CHEN Fang

（Department of Medical Cosmetology，Linyi Central Hospital，Linyi 276400，Shandong，China）

Abstract： Objective To investigate the effect of imiquimod regulating Th1 and Th2 cell-associated chemokines in wound healing and scar proliferation in rabbits. Methods 40 healthy and clean New Zealand white rabbits were selected and randomly divided into the blank group， the model group， the vaseline group and the imiquimod group， 10 rabbits in each group. The model group， the vaseline group and the imiquimod group set up rabbit ear scar model. The vaseline group and the imiquimod group were given the appropriate treatment after 14 days of surgery， the vaseline group were treated with vaseline ointment 0.1g， 1 time/d， and the imiquimod group were treated with imiquimod ointment， treatment for 42 consecutive days. The level of scar hyperplasia index （SEI）， the levels of Th1 and Th2 cell-associated chemokines CXCL10， CXCL12， CCL2， CCL3， CCL5， CCL7 and CCL13， the complete epithelialization time and wound healing time were observed and compared. Results The model group and the vaseline group reached the peak of hyperplasia in 28 days. The scar proliferation index and wound healing time of the vaseline group and the imiquimod group were lower than those of the model group， and the imiquimod group was lower than that of the vaseline group， the difference were statistically significant（P<0.05）. Compared with the model group， the levels of CCL2， CCL3， CCL5， CCL7 and CCL13 in the vaseline group and the imiquimod group were decreased， CXCL10 and CXCL12 levels were increased（P<0.05）. Compared with the vaseline group， the levels of CCL2， CCL3， CCL5， CCL7 and CCL13 in the imiquimod group were lower， and the level of CXCL10 and CXCL12 was higher（P<0.05）. There were no statistical difference in the time of complete epithelialization between the three groups （P>0.05）. Conclusion Imiquimod can regulate Th1 and Th2 cell-associated chemokines and shorten the healing time of the wound of hypertrophic scar in rabbit ears.

Key words： imiquimod； cell-associated chemokines； rabbit ear scar model； scar wound healing time； hypertrophic scar

增生性瘢痕是创伤愈合过程中皮肤上皮化后，局部组织继续增生，皮肤纤维化，胶原大量沉积，是外科临床的常见病，在各种创伤如烧伤、手术后常见[1]。目前临床仍未有较为有效的治疗方法。增生性瘢痕的发病机制至今尚不完全清楚，有学者研究证实[2]，免疫因素在此过程中具有重要作用。辅助性T淋巴（Th）细胞群是瘢痕增生过程中的重要影响因素，其是人体免疫系统中的重要免疫细胞。主要亞群Th1细胞和Th2细胞在趋化因子的作用下在瘢痕组织局部聚集，产生相关细胞因子，在瘢痕的形成过程中发挥作用[3]。咪喹莫特（Imiquimod）是近年来合成的新型免疫调节剂，已经有研究证实，其能够通过调节Th1、Th2相关因子的表达对瘢痕的增生程度产生影响，但也有学者认为咪喹莫特的调节细胞因子的作用不能对瘢痕的增生产生相关的治疗作用[4]。因此，本实验从趋化因子的角度，通过观察兔耳增生性瘢痕创面愈合时间和瘢痕增生情况，探讨咪喹莫特通过调节Th1、Th2细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13的水平，对瘢痕增生的影响情况，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 实验动物：实验动物为健康的清洁级新西兰大耳实验兔40只，年龄1.0～1.5岁，体重2.5～3.0kg，均由本院实验动物中心提供，雌雄不限。所有实验兔经编号后由本院实验动物中心负责饲养，随机分为空白组、模型组、凡士林组及咪喹莫特组，每组10只。

1.2 仪器及试剂：手术器械，打孔器，台秤，电推剪，动物实验台，0.3%戊巴比妥钠（国药准字H31021724，上海新亚药业有限公司），光学倒置显微镜（奥林巴斯），咪喹莫特软膏（国药准字H20040283，珠海联邦制药股份有限公司中山分公司），红霉素软膏（国药准字H42021726，马应龙药业股份有限公司），凡士林（赣食药准字F20050006，南昌白云药业有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 兔耳增生性瘢痕模型建立：根据 Morris和李荟元报道的方法[5-6]，对于模型组、凡士林组以及咪喹莫特组建立兔耳增生瘢痕模型。耳缘静脉缓慢注射0.3%戊巴比妥钠对实验兔进行全身麻醉，剂量1.5mg/kg，确认麻醉成功后，将实验兔固定于固定架上，在无菌条件下，采用电推剪推净兔耳双侧表面短毛，消毒后在每只兔的兔左耳耳腹侧作直径为1cm的圆形全层皮肤缺损创面6个，在此过程中避开可见血管，软骨膜一并去除，每个创面间距为1.5cm以上。对于出血处给予止血，无效时给予电凝止血，创面均涂抹红霉素软膏防止感染，暴露创面，使其自行愈合。

1.3.2 给药方法：凡士林组以及咪喹莫特组实验兔于术后14d创面完全上皮化后，给予相应的治疗措施，每组给药时间相同，凡士林组采用涂抹凡士林软膏0.1g，1次/d；咪喹莫特组外用咪喹莫特软膏0.1g，1次/d，连续42d。模型组外用1%红霉素软膏，1次/d。

1.3.3 瘢痕增生指数（Scar elevation index，SEI）检测：实验兔瘢痕最凸点至耳软骨表面的垂直距离a，瘢痕周围正常皮肤至耳软骨表面的垂直距离为b，其比值为瘢痕增生指数，其值越高，表示瘢痕的增生越明显。SEI在1.6以上为增生性瘢痕。

1.3.4 Th1、Th2细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平检测：治疗后采集所有实验兔的耳缘静脉血3ml，离心取上清液，采用ELISA法，对于所有实验兔的Th1、Th2 细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平进行检测。

1.3.5 完全上皮化时间及创面愈合时间检测：对所有实验兔的完全上皮化时间以及创面完全愈合时间进行检测。创面愈合标准为完全形成瘢痕组织。

1.4 统计学分析：计量数据以均数±标准差（x?±s）表示，采用t检验；计数资料采用%表示，采用卡方检验。采用SPSS 19.0统计软件进行数据比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验兔大体情况观察：所有建立模型实验兔术后10d可见痂皮脱落，创面上皮化时间约为13～15d，均无感染、穿孔等情况发生。所有实验兔瘢痕均有不同程度的增生，其中模型组实验兔的瘢痕增生明显，颜色红，质硬，创面中心厚；咪喹莫特组瘢痕颜色淡，表面平，质软，与周围皮肤相比表面较高，创面中心增生程度较为轻微，且未见增生高峰；凡士林组瘢痕颜色浅红，质较硬，瘢痕组织高于周围皮肤。

2.2 瘢痕增生指数（SEI）比较结果：模型组与凡士林组28d达到增生巅峰；与模型组相比，凡士林组及咪喹莫特组的瘢痕增生指数较低，差异有统计学意义（P<0.05）；咪喹莫特组的瘢痕增生指数低于凡士林组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 Th1、Th2 细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平检测结果：与模型组相比，凡士林组及咪喹莫特组的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平较低，CXCL10、CXCL12水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与凡士林组相比，咪喹莫特组的CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平降低，CXCL10、CXCL12水平较高（P<0.05）。见表2。

2.4 各组完全上皮化及创面愈合时间比较：与模型组相比，凡士林组及咪喹莫特组的创面愈合时间较短，差异有统计学意义（P<0.05）；与凡士林组相比，咪喹莫特组的创面愈合用时更少（P<0.05）。各组实验兔完全上皮化时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

人体的组织损伤修复基本都通过瘢痕组织完成，增生性瘢痕为病理性瘢痕的一种，是机体过度修复的表现，不仅影响美观，而且对于患者的身心健康也会造成影响。瘢痕的发病机制较为复杂、多样，多种因素能够对瘢痕创面的愈合产生影响，进而导致成纤维细胞的过度增生，形成增生性瘢痕，而瘢痕中通常聚集有大量的巨噬细胞、淋巴细胞等[7-9]。瘢痕增生主要由多种因素共同作用，免疫因素在其发生发展中可能发挥了十分重要的作用，而淋巴细胞有可能扮演着重要的角色。已有研究表明[10]，T淋巴细胞在增生性瘢痕的发生过程中发挥了重要作用。增生性瘢痕组织中有大量的异常增粗的胶原纤维束，T淋巴细胞的细胞凋亡与增殖平衡被打破，浸润与成纤维细胞发生相互作用，成纤维细胞分泌纤维连接蛋白和胶原蛋白，当肉芽组织成熟后，大量胶原蛋白沉积于细胞外基质，加重这一过程[11]。咪喹莫特近年来在临床的应用较为广泛。咪喹莫特为人工合成的非核苷类异环咪唑喹啉胺类药物，可被抗原递呈细胞识别，主要通过Toll样受体进行免疫识别调节，介导免疫识别，刺激相关免疫因子的合成，活化Thl细胞免疫途径，增加Thl细胞相关细胞因子的合成，抑制Th2细胞因子的产生，抑制相关免疫反应，使免疫反应倾向于Th1细胞[12-13]。已有研究表明[4]，咪喹莫特能够明显控制瘢痕疙瘩的复发，且能够改善瘢痕颜色以及硬度，疗效较好，提示了咪喹莫特对于增生性瘢痕的抑制作用。本次实验结果表明，与模型组相比，凡士林组以及咪喹莫特组的瘢痕增生指数较低，且咪喹莫特组瘢痕增生指数低于凡士林组，创面愈合时间较短。

T细胞能够调节胶原纤维的沉积其中，Th细胞分化为Th0细胞，而Th0细胞又继续分化为Th1细胞和Th2细胞等亚群，近年来的研究已经证实[14]，Th1、Th2细胞与纤维化的关系密切，Th1细胞能够减轻纤维化而Th2细胞则会促进这一过程。其中Th1细胞主要产生干扰素-γ（IFN-γ）以及白介素-12（IL-12），其中IFN-γ通过抑制胶原的合成，具有促进胶原重构的作用，因此表现为减轻纤维化以及细胞外基质降解的作用。Th2细胞能够产生包括白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-10（IL-10）等在内的多种细胞因子，其中IL-4 能够作用于成纤维细胞产生强促纤维化作用[15]。因此在增生性瘢痕的形成过程中，Th1细胞和Th2细胞相互作用，研究证实Th2细胞发挥主导作用[16]，单独改变Th1细胞或者Th2细胞中的细胞因子对于增生性瘢痕的治疗并无治疗作用，猜测可能受到了来自全身免疫细胞的调节，因此免疫细胞与病变局部细胞相互作用的上游，即趋化因子的水平与病理性瘢痕的形成关系密切。因此近年来学者将研究的重点放在Th1、Th2细胞相关趋化因子上。

趋化因子是由局部组织产生的具有化学趋化活性的一族蛋白质[17]。免疫细胞表面均有趋化因子受体，当受体与趋化因子结合时，免疫细胞就会在其作用下发生迁移。因此Th1、Th2细胞在相应的趋化因子的作用下，被迁移至创伤组织，进而产生相关细胞因子，参与增生性瘢痕的形成。研究证实[18]，局部组织趋化因子的水平可以影响Th1、Th2细胞的水平。其中趋化因子CXCL10以及CXCL12为Th1细胞表面的趋化因子，其中CXCL12炎症反应中发生选择性趋化Th1细胞。能够参与Th1介导的细胞免疫反应。CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13是Th2细胞的相关趋化因子。研究表明[16]，在瘢痕的增生过程中，Th2的相关趋化因子水平增高，而Th1细胞相关趋化因子水平均较低，Th2细胞发挥主导作用。本次实验结果表明，与正常空白组实验兔相比，各组的Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12水平均较低，Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13水平均较高。与模型组相比，凡士林组以及咪喹莫特组的Th2细胞相关趋化因子水平较低，Th1细胞相关趋化因子水平较高；与凡士林组相比，咪喹莫特组的Th2细胞相关趋化因子水平较低，Th1细胞相关趋化因子水平较高，表明本实验措施能够纠正在瘢痕增生过程中Th2细胞反应的主导地位，抑制Th2细胞反应，增加瘢痕局部组织的Th1细胞，增强Th1细胞反应，从而减轻瘢痕局部的胶原沉积，减轻纤维化。

综上，本实验通过探讨咪喹莫特调节Th1、Th2细胞相关趋化因子对兔耳增生性瘢痕创面愈合时间和瘢痕增生的影响，证实了咪喹莫特能够调节Th1、Th2细胞相关趋化因子，缩短兔耳增生性瘢痕创面的愈合时间。有助于阐明瘢痕增生的机制，在下一步研究中，将对本实验的结论作更深入的论证。

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[收稿日期]2018-01-20 [修回日期]2018-02-28

编辑/朱婉蓉