肝细胞胰岛素抵抗模型中RhoA的表达及其与胰岛素抵抗的相关性

杜一萱，郭 豪，马 玉，常晓彤

(1.河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000；2.河北北方学院临床检验诊断学重点实验室，河北 张家口 075000)

胰岛素抵抗(insulin resistance)发病机制复杂，胰岛素发挥生物学效应可分为受体前、受体和受体后3个阶段，各阶段出现问题均会产生胰岛素抵抗，其中以受体后缺陷最为常见[1]。胰岛素与受体结合后，信息经信号分子的级联放大产生生物学效应，信号分子发生异常时，导致机体代谢紊乱[2]。胰岛素通过3条信号通路影响机体糖代谢，其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K-Akt)信号通路最为关键，许多信号分子通过PI3K/Akt信号通路调节机体糖代谢。胰岛素刺激下PI3K-Akt信号转导通路调节机体各部位对糖的利用,肝脏、骨骼肌和脂肪的糖原合成，抑制糖异生[3]。RhoA是Ras超家族中具有Rho GTP酶活性的一种三磷酸鸟苷结合蛋白，分子量为21.7 kDa。ROCK是RhoA的下游作用分子，有研究表明RhoA通过Rho/ROCK信号途径参与糖尿病的发病[4]。Rho激酶的下游效应分子磷酸酶和张力蛋白同系物(phosphatase and tensin homologue,PTEN)与PI3K/Akt信号通路存在交互作用[5]。Rho激酶磷酸化后激活PTEN，活化的PTEN影响PI3K/Akt信号通路的正常转导，导致胰岛素抵抗，参与糖尿病的发生发展[6]。

我们利用本实验室已建立的肝细胞胰岛素抵抗模型，通过Western blot检测RhoA表达情况，采用生物信息学方法对RhoA与胰岛素信号通路相关蛋白的相互作用进行分析，探讨肝胰岛素抵抗下RhoA蛋白表达情况及其与胰岛素抵抗的相关性，以期为糖尿病防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

HDB-PLUs型恒温金属浴(购自北京HEROS公司)，Omega LumG凝胶成像系统(购自美国Aplegen公司)，Fresco21型低温高速离心机(购自美国Thermo公司)，XB70型制冰机(购自中国GRANT公司)，YP402N型电子秤(上海精科公司)，室温摇床，制胶板，电泳槽，电泳仪，表面皿，镊子，剪刀，小铲子。

1.1.2 试剂

兔抗人RhoA抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(3种抗体均购自北京博奥森生物技术公司)，细胞裂解液(RIPA和PMSF)，2×上样缓冲液，ECL显色试剂(购自上海联科生物技术公司)，蛋白marker，5×电泳缓冲液，5×转膜缓冲液，甲醇，1×转膜缓冲液，10×PBS，1×PBST，5%脱脂奶粉，考马斯亮蓝染液，脱色液，PVDF膜，滤纸，海绵垫，胶板。HepG2(已建立肝细胞胰岛素抵抗模型，由本室保存)。

1.2 Western blot 检测正常状态及胰岛素抵抗下RhoA蛋白的表达差异

1.2.1 HepG2蛋白的提取

从冰箱取出冻存于EP管的正常和胰岛素抵抗的HepG2细胞各一管，置于冰上解冻。解冻后，11 600 r·min-1、4 ℃离心4 min，弃去上清液，加入150 μL RIPA裂解液，再加入1.5 μL PMSF裂解抑制液，加样枪吹吸混匀使裂解液和细胞充分接触。将上述EP管置于冰上裂解半小时，期间用加样枪吹吸混匀一次。裂解完毕后，4 ℃、11 600 r·min-1离心4 min，吸出上清液放入新EP管中，加入与上清液等量的2×上样缓冲液，98 ℃金属浴5 min后取出。

1.2.2 SDS-PAGE

1.2.2.1 胶板制备 首先清洗玻璃板并擦干内表面，固定制胶器，向玻璃夹层间加入蒸馏水验漏，配制15 mL 12.5%分离胶，充分混匀后平缓注入到两玻璃板夹层，液面高度至玻璃板位置的2/3，避免产生气泡。随后加入蒸馏水至短玻璃板上缘，促进分离胶凝集并使胶面平整，室温竖直放置30 min，待分离胶与水分界时，倒掉玻璃板间的蒸馏水，滤纸吸去残留水分。用加样枪将配置好的6 mL 5%浓缩胶迅速加入玻璃夹板中，插入梳子，放置约20 min，待浓缩胶聚合后，将胶从制胶板上取下待用。胶现配现用，或者用浸湿的滤纸将胶包裹放置冰箱中备用。

1.2.2.2 SDS-PAGE 将配好的胶置于电泳槽内，向内电泳槽倒入1×电泳缓冲液，形成里高外低的液面差。按照顺序加入待测样品20 μL，加入marker作为参照。接通电源，初始电压为92 V，待上样液中溴酚蓝移动至分离胶起始处时，将电压上调至153 V，待含溴酚蓝的蛋白样品移动至玻璃板底部时，电泳结束。考马斯亮蓝染色(撬开玻璃板，切去多余的分离胶，将凝胶放入染色盘并加入染液，放在摇床染色2 h，脱色液脱色2 h，观察是否出现目的蛋白条带，改换新的脱色液，脱色过夜，观察结果，查看marker对应区域是否有目的条带)。

1.2.3 转膜

1.2.3.1 取下胶板，切去多余分离胶→裁剪滤纸和PVDF膜→甲醇浸泡5 min PVDF膜→膜与凝胶、滤纸和海绵垫在1×转膜缓冲液中浸泡15 min。

1.2.3.2 转膜准备 在转膜架上，从负极到正极排列如下：海绵垫→3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸→海绵垫，玻璃棒擀去气泡，压紧转膜架。

1.2.3.3 转膜 将上述转膜架放入电泳槽中，加入预冷的1×转膜缓冲液，将电压调至62 V，冰上转膜80 min。

1.2.4 封闭、洗膜

转膜后，取出PVDF膜，浸泡在5%脱脂奶粉中，摇床封闭2 h，1×PBST洗膜2次，PBS洗膜1次，每次10 min。

1.2.5 抗体孵育

1.2.5.1 PBS稀释一抗至适当浓度，RhoA抗体稀释比例1∶300，β-actin稀释比例1∶2500，将PVDF膜放入稀释好的抗体中孵育2 h，按照1.2.4洗膜。

1.2.5.2 PBS稀释二抗，比例为1∶2500，将PVDF膜放入配稀释好的二抗中孵育1 h。取出PVDF膜，按照1.2.4洗膜。

1.2.6显色液化学发光(ECL化学发光)

1.2.6.1 避光配置显色液，以可覆盖全膜为标准。

1.2.6.2 滤纸吸去PVDF膜上残留PBS，将PVDF膜放入上述显色液，暗处室温反应3 min。

1.2.6.3 将PVDF膜从显色液中取出，塑料薄膜平整包裹PVDF膜(避免气泡和褶皱产生)，Omega Lum G凝胶成像系统拍照记录。所有实验重复5次。

1.2.7 图像及数据分析

利用Image J软件分析RhoA和β-actin蛋白条带的灰度值，并计算灰度值之比，灰度值之比代表RhoA蛋白表达水平。采用SPSS 19.0行t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。GraphPad 8.0分析正常组和胰岛素抵抗组RhoA蛋白的相对表达量。

1.2.8 生物信息学分析

通过STRING 10.0(http://www.string-db.org/)对RhoA蛋白与胰岛素信号通路相关蛋白的相互作用进行分析。

2 结 果

2.1 RhoA表达分析

胰岛素抵抗组中RhoA在翻译水平的表达量高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

2.2 生物信息学分析

通过STRING 10.0分析预测RhoA与胰岛素信号通路相关相关蛋白的相互作用，发现RhoA与PIK3CA、ROCK1和PTEN直接相互作用(图2)。

图1 正常和胰岛素抵抗状态下肝细胞中RhoA的表达注：与正常对照组比较*P<0.05。

图2 RhoA与胰岛素信号通路相关蛋白的互作分析

3 讨 论

胰岛素抵抗导致肌肉、肝脏等组织对糖的利用率下降，机体血糖升高，进而引发糖尿病[7]。胰岛素信号通路上任何信号分子对维持胰岛素正常生理功能都有重要作用，受到任何干扰都可能影响通路正常运转[8]，通路中信号分子异常表达和相关信号通路相互作用的改变都会引起机体糖代谢紊乱[1]。

RhoA是Rho蛋白家族的小G蛋白，具有GTP酶活性，可以控制细胞膜突起的延伸、收缩和粘附，在细胞增殖、迁移等过程中发挥重要作用[9]。本研究发现胰岛素抵抗状态下RhoA表达增加，提示RhoA可能参与胰岛素抵抗的发生。经生物信息学分析可知，RhoA直接与磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)相互作用，若磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)合成减少，将直接影响胰岛素信号通路PI3K/Akt通路的正常转导。RhoA也可通过与ROCK和PTEN的相互作用影响PI3K/Akt信号通路，干预胰岛素生物学效应的正常发挥。

ROCK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[10]，广泛分布于哺乳动物的组织细胞中，与具有GTP酶活性的RhoA相互作用而被激活，参与细胞收缩、黏附、迁移、增殖和凋亡等生理过程[11]。ROCK主要有ROCK 1和ROCK 2两种亚型，其活性受RhoA激酶的调控[12]。RhoA和ROCK1蛋白的表达量在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的发病过程中显著增加[13]。磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)是一种重要的肿瘤抑制蛋白质，参与肿瘤细胞的增殖与凋亡、浸润与迁移等。RhoA通过RhoA/ROCK信号通路作用于下游底物ROCK，后者可以直接磷酸化激活PTEN[14]。已有研究证实，PTEN可使细胞内的三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-triphosphate,PIP3)去磷酸化生成二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-bisphosphate,PIP2)，从而阻断PI3K/Akt信号通路的转导[15-16]，促进胰岛素抵抗的发生。同时，葡萄糖利用障碍时持续的高血糖产生的过氧亚硝酸阴离子使PTEN的表达量升高[17]，活化泛素依赖的蛋白酶体系统，导致肌肉蛋白降解[18]，这可能是胰岛素抵抗相关疾病出现全身蛋白降解的病理机制之一。

此外，葡萄糖转运蛋白4(glucose tranporter 4,GLUT4)也为胰岛素信号通路正常转导所必需。生理情况下，GLUT4从胞内囊泡转位到细胞膜促进葡萄糖转运至胞内。胰岛素敏感的GLUT4主要表达于肌肉和脂肪组织中，在胰岛素刺激下增加葡萄糖的摄取和利用[19]。在2型糖尿病中，GLUT4易位受损，介导葡萄糖摄取障碍，产生胰岛素抵抗[19]。有研究报道胰岛素刺激下RhoA参与GLUT 4储存囊泡转运到细胞质膜的过程[20]，siRNA沉默RhoA基因表达状态下脂肪细胞和肌细胞的葡萄糖转运减少[21]，表明RhoA处于胰岛素信号转导和GLUT4囊泡运输的交叉处，可通过影响GLUT 4功能调控胰岛素信号转导。

综上，胰岛素抵抗状态下，肝细胞RhoA表达量显著升高，RhoA可能与胰岛素信号通路关键蛋白PIK3CA、ROCK1和PTEN相互作用从而影响信号通路PI3K/Akt的正常转导，参与胰岛素抵抗的发生。