胆碱激酶α与原发性肝细胞癌预后的关系研究

封 冰，王 伟，翟景明，姚国良，范永刚

河南科技大学第一附属医院肝胆胰外科，河南 洛阳 471000

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是导致癌症死亡的主要原因，2008年全球约有695 000人死于HCC[1]。肿瘤切除和肝移植为HCC患者提供了延长生存时间、改善生活质量的机会。然而，由于许多HCC患者确诊时已处于晚期或发生局部转移而不适合接受手术治疗。因此，早期检测和准确发现HCC患者对改善其临床结局至关重要。胆碱激酶α(choline kinase alpha，CHKα)在许多癌症中的过度表达引起了人们对肿瘤诊断或治疗靶点的磷脂代谢的关注[2-4]。CHKα催化磷脂的合成，磷脂是细胞膜合成的前体，也可在有丝分裂信号传导中起作用[5]。在HCC的动物模型中，肿瘤摄取的放射性标记与组织CHKα表达相关[6]，此外，胆碱类PET示踪剂用于肝癌的临床检测已在临床试验中得到支持[7]。虽然CHKα有望成为肝癌的分子靶点，但对其在HCC患者生物学中的作用及其对HCC患者生存状况的影响知之甚少。在本研究中，我们采用队列研究的方法，探索了不同CHKα表达水平对HCC患者生存状况的影响，为HCC的防治提供了理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2009年1月至2013年12月在我院接受根治性切除术治疗的HCC患者312例，术中采集患者癌组织标本并迅速置于-80 ℃冰箱保存。记录相关的临床病理特征和人口学特征。 本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准纳入标准：(1)接受根治性切除术治疗；(2)病理学检查确诊为HCC；(3)术前未接受任何抗肿瘤治疗；(4)未观察到重大器官疾病或功能异常；(5)进行血常规、尿常规、粪常规、肝功能、肾功能、心功能检查均正常。排除标准：(1)继发性HCC；(2)患有其他恶性肿瘤；(3)根治术前已接受化疗和/或放疗的患者；(4)近期接受分子靶向治疗的患者。

1.3 CHKα的检测采用Trizol试剂(美国赛默飞科技有限公司, 货号：15596026)分离提取总RNA。根据制造商的方案，采用逆转录试剂盒[南京Vazyme(诺唯赞)生物科技有限公司，货号：R223-01]，应用实时荧光定量PCR仪(qRT-PCR)[美国Bio-Rad(伯乐)生命医学产品有限公司，型号: CFX96]进行扩增。在ABI7500序列检测系统内，采用2-ΔΔCT检测CHKα的表达量。本研究所用引物如下：CHKα正向引物：5′-TGGTCCATTGTACACACA-3′；反向引物：5′-CAAGCTCCTTGGTGG-3′；β-actin正向引物：5′-AATCGTGCGTGACATAAGGAG-3′；反向引物：5′-ACTGTGTTGGCGTACAGGTCT-3′。每一个样品均进行2次测试，取平均值。

1.4 随访采用我院自制的随访登记表进行随访，随访信息包括患者的睡眠、饮食、用药情况；患者出院后的治疗情况以及患者生存状况等。随访方式：采用电话随访、上门随访以及门诊随访等多种方式相结合的方式进行随访。时间：患者出院3个月后进行首次随访，出院后1年内每3个月随访1次，2～4年每6个月随访1次，4～5年每年随访1次。生存时间：患者的生存起始时间定义为确诊时间，终点时间定义为死亡时间或者终止观察时间，总体生存时间定义为终点时间与起始时间的时间差。

2 结果

2.1 一般资料312例患者中，男249例，女63例，年龄(55.8±10.3)岁。根据Chid-Pugh分级，肝功能A级者279例，肝功能B级者33例。276例患者感染肝炎病毒。CHKα表达水平为0.63±0.12。截至2018年12月，312例HCC患者中，失访26例，随访率91.7%。在随访到的286例患者中，死亡177例。纳入研究对象的临床特征如表1所示。

表1 研究对象的一般资料 Tab 1 Clinical data of included participants

2.2 CHKα对HCC预后的预测价值CHKα对HCC预后的预测价值见图1，CHKα预测HCC死亡的最佳临界点为0.55。当CHKα为0.55时，CHKα预测HCC死亡的灵敏度为74.6%，特异度为83.5%，AUC曲线下面积为0.80。

图1 CHKα预测HCC死亡的ROC曲线 Fig 1 ROC curve of CHKα for predicting mortality in HCC patients

2.3 单因素生存分析Kaplan-Meier并Log-rank单因素分析显示，较大肿瘤(HR=1.08，95%CI：1.03～1.14)、Child-Pugh B级(HR=1.16，95%CI：1.09～1.20)、淋巴结转移(HR=1.73,95%CI: 1.12～2.04)、CHKα低表达(HR=2.35，95%CI：1.89～2.42)可增加HCC患者死亡风险(P<0.05)(见表2、图2)。

2.4 多因素生存分析将Kaplan-Meier并Log-rank分析结果显示差异有统计学意义的变量纳入Cox回归模型进行分析得出：较大肿瘤(HR=1.08，95%CI：1.03～1.14)、Child-Pugh B级(HR=1.14，95%CI：1.11～1.18)、淋巴结转移(HR=1.66,95%CI: 1.21～1.94)、CHKα低表达(HR=2.26，95%CI：1.92～2.39)是HCC患者死亡风险增加的独立危险因素(见表2)。

表2 HCC患者预后单因素及多因素生存分析 Tab 2 Univariable survival analysis and multifactor analysis of prognosis in patients with HCC

图2 CHKα表达与HCC患者生存相关性Fig 2 Correlation between the expression of CHKα and the survival for HCC patients

3 讨论

HCC已经成为中国癌症死亡的第二大原因，其死亡率占所有癌症死亡的19.33%。HCC的主要病因有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染和黄曲霉毒素[8-9]。近年来，一些非病毒性危险因素，如肥胖、饮食和饮酒等也被发现是HCC的危险因素[10]。目前，该病的主要治疗措施包括全身化疗、肝动脉灌注化疗以及索拉非尼分子靶向治疗[11]。因此，更好地理解HCC发病的分子生物学机制，发现能够预测HCC预后的分子生物学标志物至关重要。近年来，研究表明，CHKα在调节肿瘤的发展中起关键作用，从而使CHKα成为研究热点。

目前关于CHKα表达对HCC患者生存状况影响的研究十分有限。本研究通过绘制ROC曲线，发现CHKα预测HCC患者生存状况的AUC曲线下面积为0.80，灵敏度和特异度分别为74.6%和83.5%，提示CHKα作为预测HCC患者生存状况的生物标志物具有一定价值。本研究发现,CHKα表达是影响HCC患者预后的独立危险因素。CHKα表达越高，患者预后越差。CHKα高表达可以增加肿瘤患者不良预后的风险已经在多种肿瘤中得到验证。Hu等的研究表明，CHKα高表达可增加结直肠癌的进展、转移及不良预后的风险[12]。Ramírez de Molina等的研究发现，CHKα高表达可增加肺癌患者的死亡和术后复发风险[13]。这些均与本研究结果一致。

CHKα表达对肿瘤预后影响的机制尚不清楚。有文献报道，CHKα催化磷脂胆碱的生成，磷脂胆碱是一种底物，用于胞二磷胆碱(Kennedy)途径合成磷脂酰胆碱和其他膜磷脂[14]。也有研究发现，在肿瘤患者中，CHKα的表达随着细胞内磷胆碱水平的升高而升高，进而增加肿瘤细胞增殖率[15]。

综上所述，CHKα表达是影响HCC患者预后的独立危险因素，CHKα表达下调者预后差。