miR-151a-3p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

汤 杰，胥 明，李 琴

上海市东方医院消化内科，上海 200120

胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道恶性肿瘤，约90%起源于腺管上皮的导管腺癌[1]。近年来胰腺癌的发病率和死亡率明显上升，5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一[2]。胰腺癌患者发病隐匿，早期易发生侵袭转移，早期诊断率低，治愈率极低[3-4]。因此，寻找有关基因及生物治疗靶点对胰腺癌的防治有积极意义。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长21～25个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA，在多种肿瘤细胞中表达异常，参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为[5]。microRNA-151a-3p(miR-151a-3p)被Collins等[6]发现在胰腺癌组织中高表达，但是目前有关miR-151a-3p对胰腺癌细胞生物学行为的作用研究较少。因此，本研究旨在初步探讨miR-151a-3p在胰腺癌细胞中的表达水平以及过表达miR-151a-3p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，为今后胰腺癌的诊断和治疗提供新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 研究材料人胰腺癌细胞系(PANC-1、BxPC-3、AsPC-1)及正常胰腺上皮细胞HPDE6c7购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心。胎牛血清、DMEM培养基购自美国GIBCO公司；CCK-8购自碧云天生物公司；Annexin V-FITC染色试剂盒、逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自上海生工生物科技有限公司；内参U6、Trizol试剂、脂质体2000购自美国Invitrogen；Transwell小室购自美国Corning公司；miR-151a-3p mimic和mimic NC购自广州锐博生物科技公司。

1.2 细胞培养及转染将胰腺癌细胞接种于含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、体积分数为5% CO2恒温细胞培养箱中培养，待细胞覆盖率近90%时，进行细胞传代，至对数生长期时，再取细胞用于后续实验。参照脂质体2000试剂盒说明书步骤，将miR-151a-3p mimic和mimic NC分别转染至胰腺癌BxPC-3细胞中，同时设置不作任何干预的细胞为空白对照组(Blank)。转染完成后，置于体积分数为5% CO2，37 ℃，湿度95%条件下进行常规培养，2 d后用胰蛋白酶消化收集细胞用于后续实验。

1.3 qRT-PCR实验利用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，用Nano Drop 微量分光光度计测定RNA的浓度。采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒，按照说明书要求进行qRT-PCR。扩增体系为：SYBR Premix EaqTMII (2×) 2.5 μl；PCR引物各0.4 μl，模板cDNA为2 μl，加灭菌蒸馏水调整至总体积为10 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，循环40次。qRT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，引物序列见表1。以U6作为内参照，以2-ΔΔCt计算miR-151a-3p的表达量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 CCK-8实验利用CCK-8法检测胰腺癌细胞增殖活性，收集细胞，胰蛋白酶消化，以1×105ml-1的细胞密度接种于96孔板中，在37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱中培养，分别在培育0 h、24 h、48 h和72 h后，向每孔加入10 μl CCK-8试剂，使用酶标仪检测490 nm处各孔吸光度值(OD值)。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。

1.5 Transwell实验收集细胞，调整细胞密度为1×105ml-1。在迁移实验中，加入200 μl细胞悬液于Transwell小室的上室，加入500 μl含牛血清的DMEM培养基于Transwell小室的下室，置于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱中孵育24 h后，取出小室，用棉签拭去上室表面的细胞，PBS冲洗干净，4%甲醛固定 15 min，质量浓度为1 g/L的结晶紫染色20 min，再用PBS洗涤多余结晶紫，晾干后显微镜400倍镜下拍照计数，每个滤膜随机选取5个视野。在侵袭实验中，Transwell小室上室中铺 Matrigel，将Matrigel 与DMEM以1∶8 的比例进行稀释，加入上室中，37 ℃放置1 h，其余具体步骤同迁移实验。

1.6 流式细胞术实验使用Annexin V-FITC染色试剂盒对细胞凋亡进行检测，将细胞接种于6孔板中，PBS洗涤细胞2次，加入适量胰酶制成细胞悬液，离心后弃上清；取100 μg上述细胞悬液依次加入500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC，在室温下避光孵育5 min，再加入10 μg碘化丙啶(PI)(20 mg/L)，避光孵育 15 min。1 h内利用流式细胞仪上机检测，Cell Quest 软件检测分析细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 人胰腺癌细胞中miR-151a-3p的表达情况采用qRT-PCR法以HPDE6c7细胞为对照，对人胰腺癌PANC-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中miR-151a-3p表达水平进行检测，结果显示，PANC-1、BxPC-3、AsPC-1细胞中miR-151a-3p表达水平均高于HPDE6c7，差异有统计学意义(P<0.01)，且BxPC-3细胞中miR-151a-3p表达水平最高，我们选取BxPC-3细胞作为后续实验研究对象(见图1)。

注：与HPDE6c7比较，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 细胞转染后miR-151a-3p的表达水平通过qRT-PCR检测miR-151a-3p mimic的转染效率，结果显示，转染miR-151a-3p mimic的BxPC-3细胞中miR-151a-3p的表达与mimic NC和Blank组相比表达升高，差异有统计学意义(P<0.001)，表明转染miR-151a-3p mimic使miR-151a-3p过表达，转染成功(见图2)。

2.3 miR-151a-3p表达对胰腺癌细胞增殖的影响CCK-8法检测细胞增殖活性，结果显示,在24 h和48 h三组细胞的增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)；在72 h和96 h，miR-151a-3p mimic组与mimic NC和Blank组相比，细胞增殖活性提高，差异均有统计学意义(P<0.01)(见图3)。

2.4 miR-151a-3p表达对胰腺癌细胞侵袭及迁移的影响Transwell小室检测细胞迁移及侵袭，结果显示,与mimic NC和Blank组相比，miR-151a-3p mimic组细胞的迁移和侵袭数目增加，差异均有统计学意义(P<0.01)(见图4～图5)。

注：与mimic NC和Blank组比较，***P<0.001。

注：与mimic NC和Blank组比较，**P<0.01。

注：与mimic NC和Blank组比较，**P<0.01。

注：与mimic NC和Blank组比较，**P<0.01。

2.5 miR-151a-3p表达对胰腺癌细胞凋亡的影响流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示，与mimic NC和Blank组相比，miR-151a-3p mimic组细胞的凋亡率减少，差异有统计学意义(P<0.001)(见图6)。

注：与mimic NC和Blank组比较，***P<0.001。

3 讨论

在我国，近10年来胰腺癌发病率增加了1.3倍，死亡率增加了1.2倍，呈逐年上升趋势，已成为严重威胁人类健康的疾病之一[7]。目前，手术治疗、放疗、化疗仍是胰腺癌治疗的主要方式，但术后复发率高，疗效有限[8]。胰腺癌疾病的发生与发展是有一个复杂及多因素参与的过程，基因、分子水平的变化在胰腺癌的发生与发展过程中起着至关重要的作用。因此，寻找新的基因与生物治疗靶点可能为胰腺癌的治疗带来新的希望。

近年来研究表明，miRNAs通过与靶基因的3′-UTR(untranslated regions)区结合，促使靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，在转录或转录后水平调控基因表达，参与肿瘤细胞增殖、分化及凋亡等过程[9]。其中，miR-151a-3p在肝癌[10]、肺腺癌[11]、食管癌[12]、直肠癌[13]、肺癌[14]等多种肿瘤中过度表达，在肿瘤中作为致癌基因调控肿瘤进程。Collins等通过NanoString技术对胰腺癌组织及正常胰腺组织中miRNA表达谱进行测定，发现miR-151a-3p在胰腺癌组织中高表达[6]。此外，多项研究表明，miR-151a-3p 参与了多种肿瘤的发生、进展及侵袭转移等过程。Yeh等研究发现，miR-151a-3p通过靶向调控TWIST1抑制人乳腺癌细胞的迁袭及转移[15]。Mcnally等研究发现，miR-151a-3p和miR-126伴随失调与切除的胆管癌(cholangiocarcinoma，CC)中存活率的改善相关[16]。目前关于miR-151a-3p对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响研究尚未见报道。

本研究采用qRT-PCR法检测miR-151a-3p在三种胰腺癌细胞系及正常胰腺上皮细胞(HPDE6c7)中的表达，结果发现，miR-151a-3p在三种胰腺癌细胞中均表达上调，且BxPc-3细胞中miR-151a-3p表达差异最为显著，提示miR-151a-3p可能作为癌基因参与胰腺癌的发生、发展。miRNA mimic是运用化学方法合成的miRNA模拟物，能模拟细胞中成熟miRNA 的高水平表达，以增强内源miRNA的调控作用[17]。本研究进一步将miR-151-3p mimic转染至BxPc-3细胞中，qRT-PC对其转染效率进行验证，验证结果显示，转染miR-151-3p mimic 后使BxPc-3细胞中miR-151-3p过表达，miR-151-3p mimic转染成功，满足后续细胞功能学研究要求，可应用于后续细胞功能学实验。但miR-151-3p mimic为瞬时转染，故其只能应用于体外功能学实验研究，目前无法进一步进行体内实验研究。采用CCK-8法、Transwell小室、流式细胞仪分别检测miR-151-3p过表达对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，结果发现，过表达miR-151-3p显著促进了胰腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，抑制了胰腺癌细胞的凋亡，以上结果表明miR-151a-3p可能作为一种原癌基因调控胰腺癌细胞的生物学行为，为胰腺癌的诊断和治疗提供了新的分子靶点，利用分子手段干扰miR-151a-3p的表达或许成为胰腺癌治疗的新途径，但还需要进一步的实验验证。

综上所述，miR-151a-3p在胰腺癌细胞中呈异常高表达，过表达miR-151a-3p促进胰腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，抑制细胞凋亡，miR-151a-3p可能是胰腺癌的一个原癌基因，为胰腺癌的治疗提供一个新的治疗方向和干预靶点。