下调转化生长因子β激活激酶1抑制胰腺神经内分泌肿瘤转移和侵袭

杨晓玉，柏建安，孙 诚，汤琪云

南京医科大学第一附属医院 1.消化科； 2.老年消化科，江苏 南京 210029； 3.南通大学神经再生重点实验室

胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, p-NENs)是一种来源于神经内分泌系统多能干细胞的异质性肿瘤，是一种罕见的胃肠道肿瘤。近30年来，其发病率呈逐渐升高的趋势，位居胰腺肿瘤第二位，占胰腺肿瘤的3%左右[1]。手术治疗是其主要治疗手段，能够有效提高患者的预后[2]。但由于p-NENs的惰性特征，临床表现十分隐匿，很多患者在确诊时已有远处转移，因而丧失最佳手术治疗时机。此类患者也可选择药物治疗，常用的临床药物包括：生长抑素类似物、分子靶向药物等[3]，但近年来生存率并未明显提高[4]，且很多药物仍处于临床试验阶段，所以目前对于寻找新的有效的治疗靶点迫在眉睫。

转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase 1, TAK1)是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)家族的一员，能够被多种刺激所激活，包括TGF-β、TNF-α、Toll样受体配体等，活化的TAK1参与调节细胞生长、免疫反应、炎症反应等生理病理过程[5]。越来越多的报道显示，TAK1的失调与肿瘤的发生和进展有着密切关系[6]。但它在p-NENs发生、发展过程中的作用尚无报道，本研究旨在探索TAK1对p-NENs进展的影响，为临床治疗新策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人胰腺神经内分泌肿瘤细胞株(BON-1)、人正常胰腺导管上皮细胞系(hTERT-HPNE)、人胰腺导管腺癌细胞系(CFPAC-1)均购自中科院上海细胞所，胎牛血清购自美国Gibco公司，培养基DMEM和F12均购自美国Hyclone公司。RNA提取试剂盒购自南京Vazyme公司，逆转录试剂盒购自日本Takara公司，单克隆抗体TAK1 (#5206)、E-cadherin (#3195)、Vimentin (#5741)、N-cadherin (#13116)、GAPDH (#5174) 均购自美国Cell Signaling Technology公司，慢病毒表达载体于上海汉恒生物公司合成，嘌呤霉素、EdU试剂盒(C0071L)均购自上海碧云天公司，牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司，Transwell小室购自美国Coring公司，ECL显影液(#32106)购自美国Thermofisher公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染：BON-1用含有质量浓度为100 g/L胎牛血清F12培养基，CFPAC-1和hTERT-HPNE用含有质量浓度为100 g/L胎牛血清DMEM培养基，所有细胞均置于37 ℃，体积分数为5% CO2的培养箱中培养。当细胞密度为70%～80%时，用靶向TAK1的慢病毒载体以及对照病毒载体处理细胞，48 h后换含嘌呤霉素0.7 μg/ml的培养基对细胞进行7 d筛选，得到稳定敲降TAK1的细胞株(sh-TAK1)及对照组细胞株(sh-NC)。

1.2.2 总RNA提取与实时定量荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)：采用Trizol方法提取细胞中的RNA，根据说明书提取RNA后测量RNA浓度及分光光度值(A260/280在1.8～2.0)。按照Takara说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行qRT-PCR实验，GAPDH作为内参。涉及到的相关基因引物序列如下，GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；TAK1上游引物：5′-ATTGTAGAGCTTCGGCAGTTATC-3′,下游引物：5′-CTGTAAACACCAACTCATTGCG-3′。

1.2.3 MTT法检测细胞活力：将处于对数期生长的敲降组和对照组细胞接种于96孔板，每组10个复孔，每孔8 000个细胞，待细胞贴壁后加入100 μl MTT(基培1∶10稀释)，4 h后加入100 μl SDS，20 h后采用酶标仪测量570 nm处吸光度值(OD)。

1.2.4 EdU实验：将处于对数生长期的敲降组和对照组细胞接种于96孔板，每孔3个复孔，24 h后按照EdU试剂盒说明书进行操作：EdU溶液37 ℃孵育2 h后依次进行4%多聚甲醛固定、0.3% Triton-X-100破膜，EdU染色，Hoechst复染细胞核，PBS洗涤后，荧光显微镜拍照，计算两组细胞EdU阳性率。

1.2.5 Transwell实验：将sh-NC组和sh-TAK1组细胞种于6孔板，当细胞密度为80%～90%时，胰酶消化细胞，用200 μl不含血清的F12基培重悬，每孔含有2×105个细胞，种于Transwell小室的上层。侵袭实验需预先在小室上层加200 μl基质胶处理，2 h后弃掉基质胶并用PBS洗2遍，再加入处理好的细胞悬液。下层加入500 μl含有质量浓度为100 g/L胎牛血清的F12培养基，置于培养箱培养24 h后用4%的多聚甲醛固定细胞15 min，经PBS洗后，结晶紫染色30 min，PBS洗2遍后，用棉签轻轻擦拭掉小室上层细胞，在显微镜下对下层细胞进行拍照，计数。

1.2.6 Western blotting实验：处于对数期生长的两组细胞接种于6孔板，用裂解液从细胞中提取总蛋白，检测蛋白浓度。每孔加入30 mg总蛋白，经质量浓度为100 g/L 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离后，在2 h 100 V电压下，将蛋白湿转至PVDF膜上，质量浓度为50 g/L BSA封闭蛋白1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000稀释)过夜后，用TBST洗膜3～4次，每次5 min，常温孵育二抗(1∶5 000稀释)1 h，TBST洗膜3～4次，每次5 min。经ECL显影、拍照后，用Image J软件分析灰度值。

2 结果

2.1 TAK1在p-NENs细胞中高表达在BON-1、hTERT-HPNE和CFPAC-1三种细胞中检测TAK1 mRNA和蛋白表达情况。qRT-PCR结果显示，BON-1细胞中TAK1 mRNA表达显著高于其他两种细胞(P<0.05，见图1A)。BON-1细胞中TAK1蛋白质的表达水平也显著高于其他两种细胞(见图1B)，说明TAK1在p-NENs显著高表达。

图1 hTERT-HPNE、CFPAC-1、BON-1中TAK1 mRNA和蛋白质的表达情况Fig 1 The expressions of TAK1 mRNA and protein in hTERT-HPNE, CFPAC-1, BON-1

2.2 BON-1敲降TAK1的效率检测细胞转染shRNA后，检测TAK1 mRNA及蛋白质表达情况，sh-TAK1组比sh-NC组TAK1 mRNA及蛋白质的表达明显降低(P<0.05，见图2)。

注：与sh-NC组比较，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 下调TAK1对细胞增殖活力的影响MTT结果显示，sh-NC组和sh-TAK1组细胞24 h、48 h、72 h的OD值差异无统计学意义(见图3A)。EdU实验结果显示，两组细胞EdU阳性率差异无统计学意义(见图3B～3C)，与MTT结果一致，说明TAK1对p-NENs肿瘤细胞的增殖能力无影响。

图3 MTT实验和EdU实验检测TAK1下调后对细胞增殖活力的影响 A：MTT实验显示两组细胞在24 h、48 h、72 h的OD值；B：EdU实验显示EdU染色阳性细胞(红色)、细胞核染色(蓝色)；C：EdU阳性率统计(同一视野内红色细胞数/蓝色细胞数)Fig 3 MTT assay and EdU assay detected the ability of proliferation between sh-NC group and sh-TAK1 group A: MTT assay showed the OD value of cells at 24 h, 48 h, 72 h points; B: EdU assay showed that blue represented the cells’ nucleus, red represented the EdU positive cells; C: EdU positive rate (bule cells/red cells in the same view)

2.4 下调TAK1对细胞迁移和侵袭能力的影响Transwell侵袭和迁移实验显示，在下调TAK1后，穿过至小室下层的细胞数明显减少(P<0.05，见图4)，说明细胞迁移和侵袭能力减弱。

2.5 下调TAK1对EMT相关标志物的影响Western blotting结果显示，在敲降TAK1后，上皮细胞特征性标志蛋白E-cadherin比对照组表达升高，间质细胞特异性标志蛋白：Vimentin及N-cadherin表达明显降低(P<0.05，见图5)，表明在细胞TAK1表达减少后，EMT过程也受到抑制。

注：与sh-NC组比较，***P<0.001。

图4 Transwell实验检测sh-NC组和sh-TAK1组BON-1的迁移和侵袭能力变化 A：Transwell实验结果显示sh-NC组和sh-TAK1组发生迁移或侵袭至小室下层的细胞结晶紫染色情况(放大20倍)；B：sh-NC组和sh-TAK1组发生迁移和侵袭的细胞数

Fig 4 Transwell assay detected migratory and invasive ability of BON-1 between sh-NC group and sh-TAK1 group A: representative crystal violet staining photos of cells crossed to the lower chamber between sh-NC group and sh-TAK1 group; B: the cells crossed to the lower chamber of sh-NC group and sh-TAK1 group were calculated

注：与sh-NC组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨论

p-NENs是胰腺肿瘤中比较罕见的一种类型，2/3的患者好发于胰头部[7]，临床症状隐匿。近年来发病率不断升高，很多患者在发现时已发生远处转移，失去了根治性切除的治疗机会，导致其预后较差。尽管有些药物，如生长抑素类似物：奥曲肽、兰瑞肽；酪氨酸激酶抑制剂类药物：舒尼替尼等已广泛应用于临床，但不是所有患者均适合[8]，且药物治疗手段仍很局限，一旦病情进展，将面临无药可医的局面，所以寻找有效的治疗靶点迫在眉睫。

TAK1是一种重要的蛋白激酶，活化的TAK1能够激活其下游靶向分子，参与很多重要通路的调节，如NF-κB通路和MAPK信号通路[9]。研究报道，TAK1在很多肿瘤中均发挥着抑制肿瘤进展的作用，Wu等发现TAK1的缺失能够促进前列腺癌的进展[10]；在肝细胞TAK1特异性敲除的小鼠中进行体内实验，发现TAK1的缺失能够引起肝脏炎症、纤维化、肿瘤的发生[11]。此外，TAK1在有些肿瘤中又发挥着促癌作用，Iriondo等研究发现，TAK1 能够通过调节P38信号通路促进三阴性乳腺癌细胞适应肺部微环境，更易于发生肺转移[12]；在乳腺癌细胞和皮肤黑色素瘤细胞中，抑制TAK1后能够抑制细胞之间的黏附作用，从而减少癌细胞向远处迁移和侵袭[13]。但TAK1在p-NENs的作用仍未见报道。

通过研究，我们发现在正常胰腺上皮细胞、胰腺癌细胞和p-NENs细胞中，TAK1在p-NENs中表达最高。于是我们对BON-1细胞进行敲降TAK1处理来观察其对肿瘤细胞表型的影响。MTT实验与EdU实验结果均说明在下调TAK1的表达后对细胞的增殖活力无明显影响，这可能是由于TAK1影响细胞增殖或凋亡机制复杂，受多种因素调控。通过Transwell实验，我们却发现TAK1的下调能够显著抑制BON-1细胞的迁移与侵袭。

EMT过程是肿瘤细胞获得向远处转移能力的一个重要环节，通过EMT过程，上皮细胞失去极性，细胞之间连接变得不再紧密，上皮细胞变得具有间质细胞特性，获得向远处迁移或侵袭的能力[14]。据报道，抑制TAK1能够显著抑制大脑内皮细胞间质转化过程，从而减轻血脑屏障的损伤，减轻疾病的进展，比如多发性硬化症[15]。于是我们也在BON-1细胞中检测了对照组与敲降组EMT相关蛋白表达情况，发现敲降组上皮细胞标志性蛋白E-cadherin表达增加，间质细胞标志性蛋白Vimentin和N-cadherin表达减弱，说明TAK1的下调显著抑制了肿瘤细胞的EMT过程。

综上，在p-NENs细胞中，TAK1的下调能显著抑制EMT过程的发生，使肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显减弱，因此减少了细胞向远处转移的可能。所以，在p-NENs的临床治疗中，抑制TAK1很有可能作为一个新的潜在治疗靶点。