靶向APE/Ref-1基因沉默及过表达对MRC-5细胞氧化损伤的影响

王钥 张慧明 刘天睿 范采萧 熊健良 陈珏晓 张鹏霞

(佳木斯大学 1临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2基础医学院)

衰老是导致人类疾病的最大危险因子，多种慢性病、退行性疾病产生的重要原因就是氧化损伤与氧化应激。随着人体衰老，机体活性氧(ROS)大量积聚，导致氧化应激。因此，找出体内干预氧化应激过程的细胞分子生物学指标，增强细胞抗氧化能力，延缓机体衰老，对于慢性疾病的防治具有十分重要的研究价值。人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(APE/Ref)-1是一类分布广泛的生物大分子蛋白质，可控制细胞分化、凋亡和增殖，调控转录因子和氧化还原状态〔1,2〕;作为核酸内切酶它可以切除修复ROS引起的损伤的DNA碱基，治疗ROS引起的氧化应激损伤。细胞核内该基因的高表达有助于修复并减少DNA损伤。当前，在抗肿瘤药物开发方面对APE/Ref-1的研究已获得了许多新的研究进展〔3〕，而该基因对氧化损伤的人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞的影响还未见报道。有文献表明，棉酚对APE/Ref-1基因表达有抑制作用〔4〕，黄芪多糖对APE/Ref-1基因表达有促进作用〔5〕。本研究分别用黄芪多糖和棉酚使MRC-5细胞的APE/Ref-1基因表达上调和下调，验证APE/Ref-1基因对MRC-5细胞氧化损伤的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 MRC-5细胞购自中国科学院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)为HyClone公司产品；CCK-8、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、四甲基乙二酸(TEMED)、过硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺为Amresco公司产品；小鼠抗人 8-羟基-2′脱氧鸟苷(8-OHd G)抗体为Santa Cruz公司产品；FITC标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G、β-肌动蛋白(actin)和APE/Ref-1单克隆抗体为武汉博士德生物公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理 在DMEM培养液(含100 μg/ml链霉素、100 ml灭活FBS和100 IU/ml青霉素)中培养MRC-5细胞，于50 ml/L CO2、37℃、湿度适合的孵育箱中常规培养。细胞单层贴壁生长到70%～80%时，用2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶3比例分瓶传代培养，以下实验选取处于对数生长期的MRC-5细胞。

1.2.2 药物浓度的选择 取对数生长期的MRC-5细胞分别设计三组药物浓度，每组设4个复孔，在96孔板中接种，每孔接种5×103个细胞、200 μl培养液。用CCK-8法测细胞活力：丢弃孔内培养液，每孔加入CCK-8培养液(CCK-8液∶培养液=1∶9，实验前配好，现用现配混匀后加入孔中)100 μl，孵育1～4 h，酶标仪测OD值。实验均重复三次，结果取平均值。细胞增殖抑制率=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。选择最适药物浓度用于以下实验。

1.2.2.1 过氧化氢(H2O2)处理MRC-5细胞产生氧化损伤 应用3% H2O2(8.89 mol/L)，浓度分别为400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200 μmol/L，在孵育24 h后，弃原培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，换成指定H2O2浓度的培养液(空白对照组和对照组换新培养基)，孵育24 h，CCK-8检测细胞活力。

1.2.2.2 棉酚抑制MRC-5细胞APE/Ref-1基因的表达 空白组：无细胞的完全培养基；对照组：完全培养液和细胞；H2O2模型组：细胞用终浓度为 700 μmol/L的H2O2完全培养液；棉酚处理组：将20 mg棉酚溶解，制成浓度40 mg/ml的溶液，设计浓度分别为 30、25、20、15、10 μmol/L，种板孵育24 h后，H2O2模型组和棉酚处理组加700 μmol/L H2O2处理8 h后，棉酚处理组按浓度换培养液，空白组与对照组更换新培养液，H2O2模型组更换700 μmol/L的H2O2完全培养液，孵育24 h。CCK-8检测。

1.2.2.3 黄芪多糖促进MRC-5细胞APE/Ref-1基因表达 空白组、对照组、H2O2模型组处理方法同“1.2.2.2”，黄芪多糖处理组：将20 mg黄芪多糖溶解，制成浓度为20 mg/ml溶液，设计浓度梯度为100、200、400、800 mg/L。种板后孵育24 h，H2O2模型组和黄芪多糖处理组用700 μmol/L的H2O2处理8 h，黄芪多糖处理组按浓度换培养液，其他组同“1.2.2.2”更换新培养液，培养24 h。CCK-8检测。

1.2.3 CCK-8法检测各组细胞活力 对照组：含完全培养液和细胞；H2O2模型组：细胞和完全培养基培养24 h后换为终浓度为700 μmol/L的H2O2；棉酚处理组：细胞和完全培养基培养24 h后换为终浓度为700 μmol/L的H2O2处理8 h后换为终浓度为20 μmol/L的棉酚；黄芪多糖处理组：细胞和完全培养基培养24 h后换为终浓度为700 μmol/L的H2O2处理8 h后换为终浓度为200 μmol/L的黄芪多糖。CCK-8检测。

1.2.4 Western印迹检测APE/Ref-1蛋白表达情况 实验设计细胞分组及内容同“1.2.3”。细胞接种于12孔板中，每组设3复孔，每孔加约105个细胞，500 μl培养液。培养24 h后弃培养液，用预冷的PBS洗3次，加入蛋白裂解液〔含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)、10%蛋白抑制剂〕冰上静置10 min后，在冰上反复吹打，用枪头刮下并吸取至做好标记的EP管中，置低温离心机于12 000 r/min、4℃，离心10 min，取上清液至新的EP管，勿吸取白色黏稠物，加入5倍的上样缓冲液，混匀，煮沸10 min，电泳(80 V、30 min，110 V、1 h)，按目的蛋白和内参大小截取胶条，转膜。用浓度为5%的脱脂奶粉封闭1 h后，使用β-actin和APE/Ref-1的单克隆抗体，4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次取出膜，室温下敷二抗1 h，TBST洗涤3次，ECL化学发光法进行照相。

1.2.5 免疫荧光细胞化学检测8-OHd G表达 实验设计分为对照组、H2O2模型组、棉酚处理组、黄芪多糖处理组，在每组细胞爬片之后，用丙酮处理固定15 min，加 BSA 封闭液，置于37℃ 水浴孵育1 h，加小鼠抗人8-OHd G抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜；37℃复温1 h，PBS洗涤3次；加FITC标记的山羊抗小鼠IgG，37℃避光孵育2 h；用PBS冲洗每次5 min，3次，封片镜检计数。

1.3 统计学分析 应用Graphpad统计软件行方差分析，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 CCK-8测定结果

2.1.1 H2O2对MRC-5细胞的损伤作用 与对照组(抑制率为0)比较，H2O2导致的细胞损伤有浓度依赖性，且呈正比关系。H2O2浓度为400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200 μmol/L时，细胞增殖抑制率分别为(5.2±1.1)%，(10.1±2.4)%，(19.9±4.3)%，(30.7±10.7)%，(50.3±1.1)%，(71.8±4.6)%，(81.9±1.2)%，(84.9±0.7)%，(86.9±0.9)%。由此，本实验建立MRC-5氧化损伤细胞模型时H2O2浓度为700 μmol/L。

2.1.2 黄芪多糖对MRC-5细胞增殖的影响 与H2O2模型组〔抑制率为(37.0±1.1)%〕相比，不同浓度的黄芪多糖都可降低细胞的增殖抑制率，100、200、400、800 mg/L黄芪多糖组细胞增殖抑制率分别为(17.4±1.4)%、(7.7±1.4)%、(23.9±1.7)%、(28.4±1.1)%。当黄芪多糖浓度为200 mg/L处理 MRC-5细胞时，细胞活性最高，细胞增殖抑制率最低。由此，本实验以200 mg/L的黄芪多糖建立MRC-5细胞APE/Ref-1基因表达上调模型。

2.1.3 棉酚对MRC-5细胞增殖的影响 与对照组(抑制率为0)和H2O2模型组〔抑制率为(32.9±6.4)%〕相比，不同浓度下的棉酚对 MRC-5细胞生长均有抑制作用，抑制程度随棉酚浓度升高而增强，棉酚浓度为10、15、20、25、30 μmol/L时MRC-5细胞增殖抑制率分别为：(30.4±6.5)%，(38.4±6.4)%，(48.4±3.8)%，(59.2±1.7)%，(66.1±3.8)%。本实验以20 μmol/L的棉酚处理细胞，建立MRC-5细胞APE/Ref-1基因表达下调模型。

2.1.4 各实验组MRC-5细胞存活率 在H2O2处理24 h后，细胞存活率为41.68%，而相同时间下用棉酚处理后，细胞存活率为15.89%，由引说明，棉酚降低了MRC-5细胞存活率(P<0.001)。同理，相同时间下用黄芪多糖处理后，细胞存活率为68.92%，说明黄芪多糖提升了MRC-5细胞存活率(P<0.001)。见表1。

表1 各组MRC-5细胞存活率(%，n=5)

与H2O2模型组比较：1)P<0.000 1

2.2 Western印迹检测 与对照组(0.73±0.05)相比，棉酚处理组APE/Ref-1基因表达量(0.41±0.02)最少，H2O2模型组(0.48±0.03)多于棉酚组，黄芪多糖处理组APE/Ref-1基因表达量(0.77±0.05)接近对照组。见图1。

2.3 免疫荧光细胞化学检测8-OHd G表达 与对照组相比，H2O2模型组8-OHd G的表达明显增高。与H2O2模型组相比，黄芪多糖处理组表达相对减少，棉酚处理组表达相对增多。见图2。

图1 Western印迹法检测MRC-5细胞APE/Ref-1蛋白表达量

图2 不同处理条件下的MRC-5 细胞 8-OHd G表达(荧光显微镜，×600)

3 讨 论

APE/Ref-1是一类生物大分子蛋白质，存在于各种细胞中，有异质性，可有细胞核、细胞质、细胞核-质三种分布形式〔3〕。在其异常表达或者功能活性改变、分布改变时会导致细胞异常表现，使细胞凋亡，产生肿瘤、衰老等多种疾病反应，因此APE/Ref-1可能是抗氧化药物的潜在靶点〔6，7〕。APE/Ref-1表达的位置变化和(或)高表达与许多恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌等癌症的发展和预后有着不可忽视的相关性〔8〕。有文献指出减少细胞APE/Ref-1基因的表达，可以减轻肝细胞的氧化应激反应〔9〕。Biswas等〔10〕证明肿瘤内皮细胞nox-4衍生的H2O2使DNA氧化，诱导APE/Ref-1的表达；抑制APE/Ref-1表达使肿瘤体积减少50%，说明内皮细胞肿瘤的增殖依赖于APE/Ref-1的表达。异常细胞质APE/Ref-1与高级卵巢浆液腺癌的进展和化学抗性有关，预后不良〔11〕。APE/Ref-1介导的SIPR1过表达可能与AngⅡ 引起的血管功能障碍有关〔12〕。Chantre-Justino 等〔13〕发现在膀胱癌晚期患者中，APE/Ref-1等 DNA 修复酶水平高于早期患者，能修复其过剩的氧化应激损伤，促进肿瘤发展。APE/Ref-1基因高表达，能够增强细胞对H2O2、博莱霉素等的抵御能力〔14〕。局灶性脑缺血时存在DNA氧化损伤，且可检测到APE/Ref-1表达下调，导致无法修复损伤DNA，诱导细胞凋亡〔15〕。以上研究都表明，APE/Ref-1高表达可提高细胞活性，抑制细胞凋亡。APE/Ref-1的过表达或其表达部位改变在许多疾病中起着重要的作用。因此，研究机体内APE/Ref-1的表达或探讨其活性的改变可减缓机体内的氧化损伤，也有利于对此类疾病的预防和治疗，在特定部位抑制APE/Ref-1的表达可减缓肿瘤的发生。

机体内自由基的形成会引起氧化损伤从而导致脑动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、脑缺血等疾病，这类疾病产生的根本原因是氧化应激与过氧化物的堆积。事实上，身体本身存在去除和修复氧化损伤的能力。如抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)等可清除体内的自由基；DNA受到损伤时，APE/Ref-1可以作为抗氧化酶起关键作用，切除或修复损伤的DNA片段。有报道表明，大脑暂时性缺血6 h，脑内对缺血有抵抗能力的齿状回颗粒细胞中该基因表达增加〔16〕；APE/Ref-1高水平表达有助于细胞抗缺氧损伤，而低表达APE/Ref-1细胞在缺氧状态下增加了死亡率〔17〕。可见，APE/Ref-1对细胞维持生存及发挥功能有着重要作用。另据报道，APE/Ref-1可能具有减弱H2O2引起大鼠PMVECs产生氧化应激反应的作用〔18〕。APE/Ref-1基因敲除的小鼠在胚胎E3.5 d即死亡〔5〕。以上研究均提示，细胞中的APE/Ref-1表达下降时，细胞产生氧化损伤甚至死亡。但目前以APE/Ref-1为目标靶点研究氧化损伤性疾病的防治却很少。以APE/Ref-1为靶点定向提高其蛋白表达，或者当机体产生氧化损伤时减少、抑制其表达下调可防治氧化损伤性疾病，这对此类疾病的研究将具有重要的科学意义。

大量实验表明，氧化损伤可以导致细胞衰老〔19〕。细胞受到氧化损伤时出现细胞增殖抑制、周期阻滞〔20〕导致细胞衰老及死亡。H2O2是产生ROS的主要形式，H2O2对细胞作用迅速，诱导缺氧效果显著，该效果在一定范围内与浓度呈正比。它易于穿过细胞膜，在短期内引发细胞产生各种ROS，迅速引起细胞内物质过氧化、细胞功能紊乱、膜通透性增加甚至死亡〔21〕。因此，本实验选用H2O2处理细胞，建立衰老损伤模型，模拟细胞氧化损伤。

本研究发现，棉酚可抑制MRC-5细胞APE/Ref-1基因的表达；黄芪多糖可促进MRC-5细胞APE/Ref-1基因的表达；低表达APE/Ref-1基因的MRC-5细胞存活率低，高表达APE/Ref-1基因的MRC-5细胞存活率高；APE/Ref-1表达增加可降低MRC-5细胞 8-OHd G的含量。氧化损伤的MRC-5细胞，APE/Ref-1基因高表达可以减弱MRC-5细胞的氧化损伤并抑制其凋亡。因此，靶向APE/Ref-1可以作为预防和治疗氧化损伤的研究新方向，为氧化损伤性疾病、退行性疾病、肿瘤发生的阶段及预后和治疗提供新的靶点，指出了研究的新思路。